[發明專利]CS/HPMCP納米微粒在口服疫苗遞送中的應用

在審

• 申請號: 202010413064.X
• 申請日: 2020-05-15
• 公開（公告）號: CN111544583A
• 公開（公告）日: 2020-08-18
• 發明（設計）人: 肖書奇;李志偉;馬志倩;李爽
• 申請（專利權）人: 西北農林科技大學
• 主分類號: A61K39/215
• 分類號: A61K39/215;A61P31/14;A61K9/51;A61K47/38;A61K47/36;C12N15/70;C12N15/50
• 代理公司: 北京慕達星云知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 11465
• 代理人: 王敏

本發明公開了CS/HPMCP納米微粒在口服疫苗遞送中的應用，屬于動物病毒學和動物基因工程技術領域。為了檢測CS/HPMCP納米微?？诜f送的免疫效力，本發明選取豬流行性腹瀉病毒作為試驗對象；本發明通過大腸桿菌表達系統表達COE蛋白，進一步通過離子交聯方法制備了載有COE的CS/HPMCP納米顆粒，并且評估了給小鼠口服載有COE的CS/HPMCP納米微粒后，小鼠的體液免疫、細胞免疫和粘膜免疫；旨在為研發口服型納米微粒佐劑提供有力的技術支持，同時為PEDV口服型亞單位疫苗的研究奠定前期基礎。

技術領域

本發明涉及動物病毒學和動物基因工程技術領域，更具體的說是涉及CS/HPMCP納米微粒在口服疫苗遞送中的應用。

背景技術

殼聚糖(CS)是甲殼素的部分脫乙酰化形式，由葡萄糖胺和N-乙酰氨基葡萄糖單體通過β-(1-4)糖苷鍵連接形成，是一種線性聚合物。甲殼素存在于甲殼類，昆蟲和真菌細胞壁的外骨骼中，是自然界中僅次于纖維素的第二大最豐富的多糖。由于其極小的毒性，良好的生物降解性，優異的生物相容性，殼聚糖和殼聚糖衍生物已被廣泛應用在抗腫瘤、傷口敷料、化妝品、食品、組織工程和眼科等領域。此外，由于CS的陽離子特性，粘膜吸附特性，免疫刺激特性和瞬時打開上皮緊密連接的能力，其還被用來通過粘膜途徑遞送重組蛋白。為了進一步提高CS的有效性，CS通常以納米顆粒的形式應用于藥物和疫苗的遞送，因為基于納米顆粒的輸送系統具有顯著的優勢，例如可以保護封裝的抗原免于降解、控制釋放、增強抗原呈遞和引發抗原有效的交叉呈遞，從而引發CD4⁺和CD8⁺T細胞免疫反應。離子交聯是制備殼聚糖納米粒子的最常用方法，而三聚磷酸鹽(tripolyphosphate，TPP)是最常用的交聯劑。此外，羥丙甲纖維素鄰苯二甲酸酯(hydroxypropyl methylcellulose phthalate，HPMCP)是一種被食品和藥物管理局(FDA)批準用于人類的腸溶性生物降解材料，也是另一種交聯劑。該物質是制藥行業廣泛使用的腸溶包衣賦形劑之一，僅在PH5.5時才完全溶解。眾所周知，胃腸道的pH值如下：胃(pH2.0-4.0)，十二指腸(pH5.5)，空腸(pH6.0)和回腸(pH7.2-8.0)。因此，當HPMCP用于口服遞送蛋白質時，它可以減少胃中蛋白質的降解并增加腸道中蛋白質的吸收。當用HPMCP代替TPP作為交聯劑時，CS納米顆粒表現出更優異的性能，例如增加回腸中納米顆粒的粘膜吸附性以及酸穩定性。但是該納米微粒通常用于口服遞送胰島素和肝素，很少被用于蛋白質或疫苗的口服遞送，更沒有人系統地研究影響CS/HPMCP納米微粒形成的因素。

豬流行性腹瀉(Porcine epidemic diarrhea，PED)是由豬流行性腹瀉病毒(Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)引起的一種豬易感的急性高度接觸性傳染性腸道疾病。PEDV主要感染小腸上皮細胞并引起絨毛萎縮，從而導致7-10天大的乳仔豬嚴重腹瀉，嘔吐，脫水，厭食和高死亡率。PEDV的刺突(S)蛋白和S蛋白的中和表位區域(COE)是開發抗PEDV亞單位疫苗的主要候選對象。此外，通過粘膜免疫產生的初乳和牛奶中的PEDV特異性分泌型IgA(SIgA)抗體對于預防PEDV的入侵至關重要。并且，通過粘膜途徑遞送的疫苗比通過肌肉內途徑或皮下注射免疫的傳統PEDV滅活和減毒疫苗能更有效地誘導粘膜免疫。然而，妊娠母豬的口服疫苗面臨幾個挑戰，即疫苗中的有效成分可能會被胃腸道中的胃酸，胃蛋白酶和胰蛋白酶降解，而這將使得口服遞送的疫苗無法引發針對PEDV感染的有效粘膜免疫反應。

因此，提供CS/HPMCP納米微粒在口服疫苗遞送中的應用是本領域技術人員亟需解決的問題。

發明內容

有鑒于此，本發明提供了CS/HPMCP納米微粒在口服疫苗遞送中的應用。

為了實現上述目的，本發明采用如下技術方案：

CS/HPMCP納米微粒在口服疫苗遞送中的應用，具體步驟如下：

(1)構建目的基因原核表達載體，經誘導表達純化，獲得純化的目的蛋白；