[發明專利]一種用于擴增變異型靶基因片段的非淬滅型寡核苷酸探針及其應用

有效

• 申請號: 202010410919.3
• 申請日: 2020-05-15
• 公開（公告）號: CN111518800B
• 公開（公告）日: 2022-03-25
• 發明（設計）人: 唐東江;趙計昌;黃雅菁;齊盼盼;喬一愷;李雁茭
• 申請（專利權）人: 珠海圣美生物診斷技術有限公司
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;C12N15/10;C12Q1/6806;C12Q1/6886;C40B50/06
• 代理公司: 北京超成律師事務所 11646
• 代理人: 高玉光

1.一種用于擴增變異型靶基因片段的非淬滅型寡核苷酸探針，其特征在于：

（1）所述非淬滅型寡核苷酸探針的核苷酸序列與野生型靶基因片段完全匹配，與變異型靶基因片段在變異位置處發生錯配；

（2）所述非淬滅型寡核苷酸探針的長度為24~50bp長，其中在變異位置及其兩側1~5bp范圍內，至少有1~6個核苷酸經過修飾以增強所述探針與互補鏈的熱穩定性；

（3）所述非淬滅型寡核酸探針在退火時可結合野生型靶基因片段和變異型靶基因片段，在延伸時僅結合野生型靶基因片段；

所述非淬滅型寡核苷酸探針為用于擴增ESR1-D538G變異的探針18；所述探針18的核苷酸序列為GTGCCCCTCTATGACCTGCTGCTGGAGATG（SEQ ID NO:26），其中所述探針18中加下劃線的核苷酸為所述經過修飾以增強所述探針與互補鏈的熱穩定性的核苷酸；所述經過修飾為經過LNA修飾；

或者，所述非淬滅型寡核苷酸探針為用于擴增PIK3CA-E542K變異和PIK3CA-E545K變異的探針19；所述探針19的核苷酸序列為CTTTCTCCTGCTCAGTGATTTCAGAGAGAGG（SEQ IDNO.27），其中所述探針19中加下劃線的核苷酸為所述經過修飾以增強所述探針與互補鏈的熱穩定性的核苷酸；所述經過修飾為經過LNA修飾；

或者，所述非淬滅型寡核苷酸探針為用于擴增PIK3CA-H1047R變異和PIK3CA-H1047L變異的探針20；所述探針20的核苷酸序列為AACAAATGAATGATGCACATCATGGTGGCTGGACAACAA（SEQ ID NO.28），其中所述探針20中加下劃線的核苷酸為所述經過修飾以增強所述探針與互補鏈的熱穩定性的核苷酸；所述經過修飾為經過LNA修飾；

或者，所述非淬滅型寡核苷酸探針為用于擴增Braf-V600E變異的探針21；所述探針21的核苷酸序列為GGTCTAGCTACAGTGAAATCTCGATGG（SEQ ID NO.29），其中所述探針21中加下劃線的核苷酸為所述經過修飾以增強所述探針與互補鏈的熱穩定性的核苷酸；所述經過修飾為經過LNA修飾；

所述探針18~21的3’末端經雙脫氧修飾。

2.一種用于擴增變異型靶基因片段的試劑和/或試劑盒，其特征在于，所述試劑和/或試劑盒包括權利要求1所述的非淬滅型寡核苷酸探針和其他擴增試劑。

3.根據權利要求2所述的試劑和/或試劑盒，其特征在于，所述非淬滅型寡核苷酸探針為一條或多條。

4.根據權利要求3所述的試劑和/或試劑盒，其特征在于，多條寡核苷酸探針針對同一變異型靶基因，或者不同變異型靶基因。

5.根據權利要求2所述的試劑和/或試劑盒，其特征在于，所述探針與所述其他擴增試劑以單獨包裝的形式提供，或者所述探針與所述其他擴增試劑以混合的單一試劑的形式提供。

6.根據權利要求2所述的試劑和/或試劑盒，其特征在于，所述其他擴增試劑包括引物對、DNA聚合酶、緩沖液、dNTPs、無菌水和雙鏈DNA染料中的一種或多種。

7.根據權利要求6所述的試劑和/或試劑盒，其特征在于，所述其他擴增試劑為多種時，以單獨包裝的方式提供，或者所述其他擴增試劑中的至少兩種以混合的單一試劑的形式提供。

8.根據權利要求6所述的試劑和/或試劑盒，其特征在于，所述引物對由用于擴增包含所述變異型靶基因片段的變異位置的上游引物和下游引物組成，所述引物對與所述非淬滅型寡核苷酸探針在與靶基因片段結合的結合位點上無重疊或者部分重疊。