[發明專利]一種基于聲表面波和RPA擴增的檢測方法

在審

• 申請號: 202010407279.0
• 申請日: 2020-05-14
• 公開（公告）號: CN111607637A
• 公開（公告）日: 2020-09-01
• 發明（設計）人: 徐高連;侯建華;金亞南;單洪波
• 申請（專利權）人: 南京達伯可特生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/6844
• 分類號: C12Q1/6844
• 代理公司: 南京常青藤知識產權代理有限公司 32286
• 代理人: 金迪

本發明提供一種基于聲表面波和RPA擴增的檢測方法，涉及病原菌檢測技術領域，包括配制RPA核酸擴增反應液，將RPA核酸擴增反應液放置于聲表面波的傳播途徑上，將RPA核酸擴增反應液滴在壓電材料表面或者將聲表面波器件與RPA核酸擴增反應液接觸，叉指換能器添加正弦電壓，通過變壓器調整輸入電壓的數值，靶核酸序列即可進行擴增，通過在反應過程中加入染料。本發明操作簡單，效率高，特異性高，應用廣泛。

技術領域

本發明屬于病原菌檢測技術領域，具體涉及一種基于聲表面波和RPA擴增的檢測方法。

背景技術

根據世界衛生組織對全球的流行病趨勢調查研究表明，以往常規的病原菌檢測方法(例如細菌培養、外部形態結構和生理生化鑒定以及血清學鑒定等)由于其耗時費力、步驟繁瑣和對儀器設備的依賴等不足，已經無法有效的滿足人類對致病微生物進行快速和特異檢測的要求。分子生物學技術的快速發展，使得人們可以從分子水平來對目前常規檢測手段難以檢測的病原微生物進行快速/正確地鑒定，極大的提高病原菌的檢測水平，并對傳染病傳播的起到了良好的控制效果。目前，高度敏感、高度特異的核酸擴增技術可以直接在不需要對病原微生物進行分離培養的基礎上直接用于臨床標本的檢測，并能在較短時間內(2-3小時)得出結果，在感染性疾病的診斷中應用越來越廣泛。這些分子檢測技術與其他分子生物學技術以及生物信息學手段結合，正向快速朝著準確、快速、靈敏以及自動化的方向發展。

重組酶聚合酶擴增(Recombinase Polymerase Amplification,RPA)被稱為可以替代PCR的核酸檢測技術。RPA技術主要依賴于三種酶：能結合單鏈核酸的重組酶，單鏈DNA結合蛋白(SSB)和鏈置換DNA聚合酶。這三種酶的混合物在常溫下也有活性，最近反應溫度在37℃左右。PRA的擴增步驟一般可分為：1.重組酶與引物結合形成的蛋白-DNA復合物，能在雙鏈DNA中尋找同源序列。一旦引物定位了同源序列，就會發生鏈交換反應并啟動DNA的延伸和合成，對模板上的目標區域進行指數式擴增。被替換的DNA鏈與SSB結合，以防止進一步替換。在該體系中，由兩隊相對的引物起始一個DNA合成事件。整個過程非常迅速，一般可以在十分鐘之內獲得可檢測的水平的擴增產物。

但是由于RPA的反應溶液中存在比較大量的PEG，這使得反應溶液的粘度非常高，不利于的RPA的進行，從而達到有效快速擴增靶向核酸序列的目的。因此，在目前的RPA使用過程中，一般采用兩種策略來解決由于RPA反應溶液粘度高所帶來的一系列問題：分別采用震蕩渦旋的方式和在反應溶液中加入磁性顆粒進行攪拌的方式。前者需要對反應進行適時中止，這不僅會延長檢測的時間而且還容易造成擴增產物的污染；后者則需要比較要磁力攪拌器，這不利于儀器的集成和自動化。

因此急需提供一種操作簡單，效率高，特異性高，應用廣泛的基于聲表面波和RPA擴增的檢測方法。

發明內容

本發明的目的是提供一種基于聲表面波和RPA擴增的檢測方法。

本發明提供了如下的技術方案：

一種基于聲表面波和RPA擴增的檢測方法，包括如下步驟：

S1.配制RPA核酸擴增反應液；

S2.將RPA核酸擴增反應液放置于聲表面波的傳播途徑上，將RPA核酸擴增反應液滴在壓電材料表面或者將聲表面波器件與RPA核酸擴增反應液接觸；

S3.叉指換能器添加正弦電壓，通過變壓器調整輸入電壓的數值，靶核酸序列即可進行擴增；

S4.通過在反應過程中加入染料，當反應中的靶向基因濃度不斷升高時，相應的染料信號逐漸發生變化。

優選的，叉指換能器中的叉指數量為10-30個，工作頻率為5-30MHz。

優選的，步驟S2中的壓電材料為石英晶體、鎵酸鋰、鍺酸鋰、鍺酸鈦、鐵晶體管鈮酸鋰和鉭酸鋰中的一種。