[發明專利]質譜法檢測霉菌的前處理方法

在審

• 申請號: 202010399825.0
• 申請日: 2020-05-13
• 公開（公告）號: CN111678968A
• 公開（公告）日: 2020-09-18
• 發明（設計）人: 宋海平;靖廣旭;包克非;李桃
• 申請（專利權）人: 重慶中元匯吉生物技術有限公司
• 主分類號: G01N27/62
• 分類號: G01N27/62;C12Q1/04
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發明公開了質譜法檢測霉菌的前處理方法，包括以下步驟：潤濕霉菌采集器的頭部，充分粘取霉菌樣品；將霉菌與前處理試劑充分混合形成懸濁液。本發明方法不涉及離心步驟，可以簡單、快速地提取霉菌總蛋白，得到信號強、區分度高的特征峰譜圖，使最終鑒定結果具有更為穩定可靠。

技術領域

本發明涉及用于微生物質譜法檢測霉菌的前處理方法。特別是，本發明涉及使用質譜分析法快速表征和/或鑒定測試樣品中的霉菌的方法。

背景技術

臨床上，絲狀真菌(即霉菌)感染常發生在腫瘤、艾滋病、惡性血液病、器官移植、透析、糖尿病、大面積燒傷、創傷等患者。霉菌感染對人體危害嚴重，治療困難，由其引起的血流感染和侵襲性肺部感染及其他器官感染往往是致命性的，而不同種屬霉菌對抗真菌藥物的敏感性不同，因此，實驗室確定霉菌種屬非常重要。

過去霉菌實驗室診斷主要依靠形態學，即培養觀察菌落形態、菌絲、孢子及產孢結構的特點進行鑒定，這種方法費時長，一般需要數天甚至數周時間，且受檢驗人員專業技術水平限制，不能滿足臨床需要。近年來臨床實驗室采用PCR，基因測序、MALDI-TOF質譜儀等先進的技術方法來鑒定霉菌，但是前兩種方法實驗成本高、技術復雜且費時，一般實驗室難以開展；

MALDI-TOF質譜方法基于質譜儀自帶的數據庫對培養的菌株蛋白質分子譜系分析來對微生物鑒定診斷，其鑒定正確度高，具有成本和技術優勢及很高的應用價值，隨著質譜技術的不斷完善和發展，MALDI-TOF MS技術在臨床細菌和酵母快速鑒定研究中的作用日顯突出，已在一些大型實驗室普遍應用，但對于霉菌的鑒定準確性依舊很難保障。

為了進一步提高MALDI-TOF MS質譜儀鑒定霉菌的總體準確率，霉菌樣本前處理方法的優化及更完善數據庫匹配是關鍵，也是難點，因為霉菌菌落形態較大，質地疏松，外觀干燥，尤其是菌落和培養基間的連接緊密，不易挑取。目前市面上針對真菌樣本的前處理并沒有統一規定的方法，并且整體處理流程操作繁瑣，費時較長，鑒定水平也參差不齊。查閱相關專利,主要涉及用于細菌及酵母類真菌鑒定的菌體預處理方法較多，針對霉菌的前處理方法甚少。常見的方法有：①乙醇甲酸法，首先用從固體或半固體培養基中獲取未知霉菌樣品，并將未知絲狀真菌樣品重懸于水中，將乙醇加入容器中并混合，通過離心沉淀測試樣品中的菌體并除去上清液后，將真菌沉淀重懸于甲酸中并混合，再加入乙腈并混合，離心容器，最后回收上清液。該方法為目前常規的提取法，鑒定準確率尚可，但該處理流程操作繁瑣，費時較長，在操作過程中丟棄大量菌體胞外蛋白信息，一定程度上影響某些難鑒定性霉菌鑒定的準確性，也不適合臨床大量真菌標本鑒定和需要快速出鑒定結果的應用場景。②改良直涂法：復蘇點種后的菌株，在生物安全柜中用無菌10μl Tip頭蘸取菌落產孢處與菌絲交界處的菌絲少許，直涂于已加1μl甲酸的質譜靶板靶孔中研磨成膠胨狀，自然晾干后加1μl乙腈，待其晾干后再加上1μl CHCA基質溶液，室溫下自然晾干。同時點1μl標準品在質譜靶的另一孔位，覆蓋1μl CHCA基質溶液，室溫下自然晾干，然后進行質譜鑒定。該方法在前處理時間上進行了優化，但操作精細程度要求較高，孢子和菌絲體直涂難度大，破壁效果較差，影響最終的鑒定結果。此外，還有改良的液體培養法和磁珠研磨法等，但因操作繁瑣，臨床不易推廣。且目前涉及的霉菌前處理均涉及離心過程，其使鑒定時間增加且會導致部分蛋白信息丟失、影響鑒定結果。

發明內容

為了解決以上現有技術繁瑣耗時、不易推廣、霉菌鑒定不準的難題，本發明提供了質譜霉菌前處理方法，用無需離心的簡便操作方法，快速實現霉菌種屬鑒定。

在一方面，本發明涉及用于質譜霉菌前處理方法，該方法包括如下步驟：

(a)潤濕霉菌采集器的頭部，充分粘取霉菌樣品；

(b)將霉菌與前處理試劑充分混合形成懸濁液；

所述前處理試劑包括甲酸和乙腈。

作為優選，所述前處理試劑還包括三乙胺。