[發明專利]燕麥鐮刀菌的RT-QPCR檢測的引物、探針、試劑盒及方法

在審

• 申請號: 202010370387.5
• 申請日: 2020-05-06
• 公開（公告）號: CN111471795A
• 公開（公告）日: 2020-07-31
• 發明（設計）人: 張鐳;車團結;沈頌東;朱建寧;孫宗科;石勇;高愷;李瀟玲;鄭曉玲
• 申請（專利權）人: 蘭州百源基因技術有限公司
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12Q1/6851;C12N15/11;C12Q1/06;C12N15/70;C12R1/77;C12R1/19
• 代理公司: 成都九鼎天元知識產權代理有限公司 51214
• 代理人: 劉小彬

本發明公開了燕麥鐮刀菌的RT?QPCR檢測的引物、探針、試劑盒及方法，屬于生物技術領域。上游引物和下游引物的核苷酸序列分別如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示，探針的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；試劑盒包括上述引物及探針。熒光定量PCR檢測方法包括：提取待測樣品總DNA；制備反應體系；將模板梯度稀釋制成標準曲線樣品及陽性對照樣品；將待測樣品、標準曲線樣品、陽性對照樣品、陰性對照樣品使用引物和探針進行熒光定量PCR擴增；繪制標準曲線，計算結果。本發明的引物、探針及試劑盒，具有高度特異性和良好的靈敏度，能快速、準確度地燕麥鐮刀菌進行檢測。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體涉及燕麥鐮刀菌的實時熒光定量PCR檢測的引物、探針、試劑盒及方法。

背景技術

燕麥鐮刀菌(Fusarium avenaceum)是一類世界性分布的真菌，可侵染小麥、燕麥、大豆等糧食作物和百合、菊花等藥用花卉。燕麥鐮刀菌常常引起植物出現根腐、莖腐、莖基腐、花腐等多種病害癥狀，受感染的寄住植物多大100余種。燕麥鐮刀菌經常浸染寄主植物的維管束系統，破壞植物的疏導組織，并在植物生長發育過代謝程中產生毒素來危害作物，造成植物萎蔫死亡，影響產量和品質。燕麥鐮刀菌是生產上防治最艱難的重要病害之一。多年來，人們都是依據形態學特征、致病性及營養體融合群等試驗來研究該菌的的多態性，而這些方法既費時又費力又不能準確地揭示物種的進化關系。

現有技術中，采用多重PCR檢測燕麥鐮刀雖然特異性好、準確性高，然而其PCR結果需要通過瓊脂糖電泳進行分析，影響因素較多。隨著分子生物學技術的不斷發展，RT-QPCR(實時熒光定量PCR)目前已廣泛應用于菌種的檢測。其與常規的分離培養方法相比，具有耗時短、操作簡便、特異性好的特點，且結果可直接觀察，能有效避免操作過程中引起的污染。但燕麥鐮刀與其它鐮刀屬菌種有著較高的同源性，如腐皮鐮刀菌、三線鐮刀菌、尖孢鐮孢。因此提供一種用于燕麥鐮刀菌的PCR檢測方法，具有高度特異性，準確度高，成為了本領域技術人員亟待解決的問題。

發明內容

本發明的目的之一在于，提供一種燕麥鐮刀菌的RT-QPCR檢測的引物，特異性好，準確度高。

本發明的目的之二在于，提供一種燕麥鐮刀菌的RT-QPCR檢測的探針。

本發明的目的之三在于，提供一種燕麥鐮刀菌的RT-QPCR檢測的試劑盒。

本發明的目的之四在于，提供一種燕麥鐮刀菌的RT-QPCR檢測的方法。

為實現上述目的，本發明采用的技術方案如下：

本發明通過對NCBI數據庫中燕麥鐮刀菌18SrRNA基因全序列進行生物信息學比對分析，選取適合設計引物和探針的保守片段序列為靶目標，并進一步應用Primer express3軟件、Primer Premier 5軟件以及Oligo 7軟件，設計了多組實時熒光定量PCR引物與探針，經過試驗初步篩選，最終確定了一組用于檢測燕麥鐮刀菌的熒光定量PCR引物和探針。

本發明所述的燕麥鐮刀菌的RT-QPCR檢測的引物，所述引物包括上游引物和下游引物，其核苷酸序列分別如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示，

上游引物：5'-ATCGATGAAGAACGCAGCAA-3'；

下游引物：5'-CGATCCCCAACACCAAACCC-3'。

本發明所述的燕麥鐮刀菌的RT-QPCR檢測的探針，該探針的核苷酸序列如 SEQ IDNO:3所示：5'-CCTGTTCGAGCGTCATTTCAACCCT-3'；優選地，所述探針5’端標記的熒光報告基團為VIC，3’端標記的熒光淬滅基團為BHQ。

18SrRNA基因廣泛存在于燕麥鐮刀菌中，具有很高的保守性。本發明采用燕麥鐮刀菌18SrRNA基因作為靶序列，合成了引物及探針。