[發明專利]一種細胞培養基及其培養NK細胞的方法

有效

• 申請號: 202010335730.2
• 申請日: 2020-04-24
• 公開（公告）號: CN111548994B
• 公開（公告）日: 2021-05-25
• 發明（設計）人: 李文東;宋云慶;黎波;盧瑞珊
• 申請（專利權）人: 廣東華夏健康生命科學有限公司
• 主分類號: C12N5/0783
• 分類號: C12N5/0783;C12N5/078
• 代理公司: 廣州三環專利商標代理有限公司 44202
• 代理人: 顏希文

本發明公開一種細胞培養基及其培養NK細胞的方法，所述一種細胞培養基，其特征在于，所述培養基為含有體積百分比為10％的滅活血漿，以及500～1500U/mL IL?2的ALyS505NK?AC培養基；本發明用于培養NK細胞的培養基使用滅活血漿，并創造性只使用一種細胞因子(IL?2)，能夠大大降低NK細胞培養中的成本。本發明培養基用于培養NK細胞，操作步驟更簡單，用時短，并能獲得數量充足的細胞數量，擴增數量能達到2×10⁹以上；此外，本發明不僅僅局限于擴增NK細胞，還能夠全方位提高NK細胞的生物活性。

技術領域

本發明屬于再生醫學和生物學技術領域，涉及NK細胞的培養及制劑制備的方法，尤其是一種細胞培養基及其培養NK細胞的方法。

背景技術

自然殺傷細胞(Natural killer cells，NK cells)是一群不同于T、B淋巴細胞的大顆粒淋巴細胞，分布于外周各淋巴器官及血液循環系統，無需抗原的預先刺激與活化即可發揮細胞毒效應，并可分泌多種細胞因子及趨化因子，是機體天然免疫的主要承擔者，也是獲得性細胞免疫的核心調節細胞，在腫瘤免疫、抗病毒感染及清除非己細胞中發揮重要作用。NK細胞過繼性免疫治療是目前臨床上腫瘤細胞免疫治療的重要手段。由于外周血中NK細胞含量少(約占淋巴細胞的5％一10％)，體外擴增高效的NK細胞則成為NK細胞治療的關鍵問題之一。

許多體外研究均顯示IL-2、IL-12、IL-15對促進NK細胞的成熟、活化、增殖及細胞毒活性有重要作用。但經過研究發現，使用IL-2、IL-12、IL-15等細胞因子的不同組合在一定程度上可以擴增體外的NK細胞，但是外周血樣品年齡、是否化療等條件直接影響了NK細胞的體外擴增成功與否，說明了現有培養體系的穩定性較差。本發明對現有技術進行了培養體系的優化改進，僅使用的1-2細胞因子，結合新的培養基，保證各類型血液樣品都能擴增成功，年齡段因此我們首先從方法學角度探索提高NK細胞純度的方法并采用IL-2、IL-12、IL-15等細胞囚子的不同組合，以期提高NK細胞體外擴增的效率及純度，并進一步從NK細胞穿孔素、顆粒酶B mRNA的表達水平及IFN的分泌水平評價擴增后NK細胞的功能變化，為進一步的臨床應用奠定基礎。

目前NK細胞的培養體系復雜，添加的細胞因子種類繁多，且細胞擴增效果還有待提高。

發明內容

本發明的目的在于針對上述現有技術的不足之處而提供一種培養體系更簡單，且能穩定擴增NK細胞，并提高其活性的方法。

為實現上述目的，本發明采取的技術方案為：一種細胞培養基，所述培養基為含有體積百分比為5～20％的滅活血漿，以及500～1500U/mL IL-2的ALyS505NK-AC培養基。

體外細胞培養使會加入一定量的血清，一般為胎牛血清，其含有豐富的細胞生長必須的營養成份，對細胞的正常生長具有重要的作用。然后，胎牛血清價格昂貴，且還可能由于處理過程不規范帶來污染或者牛源性病毒污染，影響后續的細胞培養。使用滅活血漿價格相對更便宜，且血漿的滅活方法簡單，能大大節省成本，并減少污染的發生。

另外，一般NK細胞培養需要IL-2和IL-12、IL-15等多種細胞因子，本發明培養基僅涉及IL-2一種細胞因子，成本更低，操作更簡單。

作為本發明的優選實施方式，所述培養基中IL-2的濃度為1000U/mL。

作為本發明的優選實施方式，所述滅活血漿的制備方法為：將血樣于2000rpm離心15min，吸取上層血漿至新的離心管中；密封好置于56℃滅活20～50min；2500～3500rpm離心15min，取上層溶液即為所述滅活血漿。

本發明還要求保護所述培養基在誘導PBMC分化成NK細胞的用途。

本發明的培養基用于NK細胞的培養所獲得的細胞數量充足，細胞活性高。

本發明還提供了所述培養基用于培養NK細胞的培養方法，包括以下步驟：