[發(fā)明專利]一種細(xì)胞培養(yǎng)基及其培養(yǎng)NK細(xì)胞的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202010335730.2
• 申請日: 2020-04-24
• 公開（公告）號: CN111548994B
• 公開（公告）日: 2021-05-25
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 李文東;宋云慶;黎波;盧瑞珊
• 申請（專利權(quán)）人: 廣東華夏健康生命科學(xué)有限公司
• 主分類號: C12N5/0783
• 分類號: C12N5/0783;C12N5/078
• 代理公司: 廣州三環(huán)專利商標(biāo)代理有限公司 44202
• 代理人: 顏希文

1.一種NK細(xì)胞的培養(yǎng)方法，其特征在于，包括以下步驟：

1)在培養(yǎng)容器中孵育15～20min的Lymactin-NK抗體，然后丟棄Lymactin-NK抗體液；

2)在步驟1)所述的容器中加入細(xì)胞培養(yǎng)基，并將PBMC接種于所述細(xì)胞培養(yǎng)基中，該操作時間計為第0天；

3)于第3、5天進行補液，補加含有500～1500U/mL IL-2的ALyS505NK-AC培養(yǎng)基；

4)在第7天進行補液，補加含有500～1500U/mL IL-2的ALyS505NK-EX培養(yǎng)基；

5)在第9、11天進行補液，補加含有1000U/mLIL-2的ALyS505NK-EX培養(yǎng)基，即得到NK細(xì)胞；

所述細(xì)胞培養(yǎng)基為含有體積百分比為5～20％的滅活血漿，以及1000U/mL IL-2的ALyS505NK-AC培養(yǎng)基；

所述滅活血漿的制備方法為：將血樣于2000rpm離心15min，吸取上層血漿至新的離心管中；密封好置于56℃滅活20～50min；2500～3500rpm離心15min，取上層溶液即為所述滅活血漿。

2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟2)PBMC的接種密度不低于1×10⁶cells/mL。

3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟2)中，所述培養(yǎng)基中的滅活血漿與所述PBMC來源于同一供體。

4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，還包括利用ficoll密度梯度離心法分離血樣中PBMC的過程。

5.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述血樣為外周血。

6.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述ficoll密度梯度離心法分離血樣中PBMC的過程如下：

1)抽取外周血30mL，2000rpm離心15min；

2)吸取離心后的血樣的下層血細(xì)胞層，并用一次性移液管加入等量生理鹽水稀釋，混合均勻；

3)另取新的離心管，加入淋巴細(xì)胞分離液，并將稀釋后的下層血細(xì)胞溶液緩慢轉(zhuǎn)移至淋巴細(xì)胞分離液的表面，使二者之間形成清晰的界面，所述下層血細(xì)胞溶液：淋巴分離液的體積比為1:1；

4)2000rpm，離心15min；

5)離心后將上層含有PBMC層液體吸出，轉(zhuǎn)移至另一支離心管中，注意不要將紅細(xì)胞層一并吸出；

6)用一次性移液管加RPMI 1640培養(yǎng)基重懸PBMC，500g離心5min，棄上清，即得所述PBMC。