[發(fā)明專利]一種類I型膠原蛋白纖維的制備方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202010327199.4
• 申請(qǐng)日: 2020-04-23
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN111333715B
• 公開(kāi)（公告）日: 2021-04-13
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 許菲;胡金遠(yuǎn);維卡斯·南達(dá);戴維·史瑞伯;張萌;鎖娜兒·格拉瓦特
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 江南大學(xué);羅格斯大學(xué)
• 主分類號(hào): C07K14/78
• 分類號(hào): C07K14/78;C12N15/12;C12N15/70;C12N1/21;C12P21/06;C12R1/19
• 代理公司: 哈爾濱市陽(yáng)光惠遠(yuǎn)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 23211
• 代理人: 仇鈺瑩

本發(fā)明公開(kāi)了一種類I型膠原蛋白纖維的制備方法，屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明以N和C端(GPP)_n序列為基礎(chǔ)，在中間插入連續(xù)的Gly?Xaa?Yaa三聯(lián)體的膠原蛋白序列，形成三段式的嵌合膠原蛋白P?CL?P模式。通過(guò)N和C端的(GPP)n三股螺旋間的相互作用驅(qū)動(dòng)自組裝，形成具有周期性明暗相間條紋的帶狀纖維。本發(fā)明的方法可制備得到清潔來(lái)源的能自組裝形成具有周期性明暗相間條紋的纖維，其結(jié)構(gòu)與I型膠原蛋白類似，制備工藝簡(jiǎn)單，能夠大規(guī)模生產(chǎn)成本低的膠原蛋白纖維，在生物材料領(lǐng)域有著廣闊的應(yīng)用前景。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種類I型膠原蛋白纖維的制備方法，屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

膠原蛋白是一種生物性的高分子，是由三條鏈相互纏繞形成的三股螺旋結(jié)構(gòu)。膠原蛋白根據(jù)其基因序列和功能作用可分為28種類型，其中最為主要是的I型膠原蛋白。在高等生物細(xì)胞中，I型膠原的原蛋白經(jīng)過(guò)翻譯后修飾、折疊、切割等一系列成熟化過(guò)程后，多個(gè)膠原蛋白三股螺旋(簡(jiǎn)稱膠原蛋白)交錯(cuò)排列，形成間距均勻的明暗條紋狀的膠原蛋白纖維(圖1),其形貌對(duì)于細(xì)胞的粘附與生長(zhǎng)有關(guān)鍵性的作用^[1]，也是促進(jìn)人體組織和器官的修復(fù)和再生的生物材料。

I型膠原蛋白主要用于治療皮膚燒傷的創(chuàng)面敷貼、外科和牙科手術(shù)的止血海綿、骨缺損填充物等生物醫(yī)用材料中，也廣泛應(yīng)用于化妝品與食品工業(yè)中，市場(chǎng)需求量龐大。目前市場(chǎng)上的I型膠原蛋白產(chǎn)品主要是來(lái)源于動(dòng)物皮膚與跟腱等結(jié)締組織，其主要優(yōu)點(diǎn)是生物兼容性高、易被人體吸收，但是易被動(dòng)物源帶有的疾病如朊蛋白等污染。為了提高膠原材料的生物安全性，如何制備清潔來(lái)源的I型膠原蛋白是生物醫(yī)學(xué)材料領(lǐng)域中備受關(guān)注的問(wèn)題。

目前主要有以下三種制備方法：(1)化學(xué)合成膠原樣多肽，(2)原核與真核微生物宿主異源表達(dá)重組膠原蛋白，(3)高等生物宿主異源表達(dá)，如轉(zhuǎn)基因植物培育、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)。化學(xué)合成的膠原樣多肽雖然具有純度高、易于修飾功能基團(tuán)等優(yōu)點(diǎn)，但是制備成本過(guò)高，不利于大規(guī)模生產(chǎn)。轉(zhuǎn)基因植物和哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)體系的普遍問(wèn)題是培養(yǎng)條件嚴(yán)苛、表達(dá)量低、生產(chǎn)周期長(zhǎng)。微生物表達(dá)體系具有成本低和表達(dá)量高等明顯優(yōu)勢(shì)。目前研究表明，越來(lái)越多的哺乳動(dòng)物和細(xì)菌膠原被證實(shí)能夠在細(xì)菌和酵母等宿主中高效的異源表達(dá)，并且正確折疊成膠原蛋白三股螺旋。重組膠原在生物材料生產(chǎn)中具有潛在的應(yīng)用，但是缺乏形成高級(jí)結(jié)構(gòu)的自組裝驅(qū)動(dòng)力，不能形成膠原蛋白纖維，限制了其在生物材料和組織工程方面的應(yīng)用。Barbara Brodsky等人通過(guò)表達(dá)全長(zhǎng)和兩倍長(zhǎng)度的釀膿鏈球菌膠原蛋白Scl2，切除球狀引導(dǎo)折疊域后的膠原區(qū)域能夠自組裝形成纖維，通過(guò)加長(zhǎng)序列長(zhǎng)度能夠促進(jìn)自組裝的能力，但是這些重組膠原序列無(wú)法形成與天然膠原類似的、具有規(guī)整明暗條帶的納米纖維形貌^[2]。

參考文獻(xiàn)：

1.Friedrichs,J.,A.Taubenberger,C.M.Franz,and D.J.Muller,CellularRemodelling of Individual Collagen Fibrils Visualized by Time-lapseAFM.Journal of Molecular Biology,2007.372(3):p.594-607.

2.Nelson,D.L.,A.L.Lehninger,and M.M.Cox,Lehninger principles ofbiochemistry.2008:Macmillan.

發(fā)明內(nèi)容

本申請(qǐng)通過(guò)在不同來(lái)源的膠原蛋白的N端和C端融合表達(dá)(GPP)₁₀，促進(jìn)膠原蛋白的高聚自組裝，形成膠原蛋白纖維。

本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一種類I型膠原蛋白，由三條蛋白單鏈圍繞一個(gè)共同的中心軸盤繞，構(gòu)成三螺旋結(jié)構(gòu)；所述蛋白單鏈的氨基酸排布方式為：其中，(GPP)_n的n滿足5＜n≤30，CL-domain的氨基酸序列如SEQID NO.2～6任一序列所示。