[發明專利]新型冠狀病毒qRT-PCR一步法試劑盒反應液及其試劑盒和方法

在審

• 申請號: 202010316736.5
• 申請日: 2020-04-21
• 公開（公告）號: CN111621595A
• 公開（公告）日: 2020-09-04
• 發明（設計）人: 禹文峰;張遠波;梁貴友;黃智;高睿;王碧
• 申請（專利權）人: 貴州醫科大學
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/686;C12N15/11
• 代理公司: 北京棧橋知識產權代理事務所(普通合伙) 11670
• 代理人: 潘衛鋒

本發明公開了一種新型冠狀病毒qRT?PCR一步法試劑盒反應液及其試劑盒和方法，包括包括：PT?PCR反應液、酶混合液、Solution、特異性引物及探針，且Solution的配方為：(NH₄)₂SO₄ 20～40mM、吐溫20 1.8E^?6～3.6E^?6、三氮化鈉4.5E^?2～9E^?2、甘油0.05～0.1mM、二甲基亞砜0.07～0.14mM、牛血清蛋白1.5E^?7～3E^?7；包括含有已知ORF1ab基因或N基因、Solution配方的試劑盒；包括試劑盒的檢測方法。本發明可有效降低已知基于ORF1ab基因或N基因靶標的qRT?PCR檢測技術對2019?nCoV新型冠狀病毒檢測出現假陰性的情況，從而提高試劑盒診斷準確性，降低減少傳染隱患、安全風險以及資源消耗。

技術領域

本發明涉及生物技術應用領域，具體是涉及一種新型冠狀病毒qRT-PCR一步法試劑盒反應液及其試劑盒和方法。

背景技術

新型冠狀病毒在臨床實踐過程中，一些弱癥狀、病毒載量低的初診患者樣本、樣本中抑制物高的患者樣本、治療后待復核出院的患者樣本等，不能被明確診斷，造成了極大的傳染隱患、安全風險以及資源消耗。

因此，在使用已知的qRT-PCR技術檢測和定量分析樣品使用ORF1ab基因或N基因進行檢測，為了減少和避免檢測結果的假陰性或假陽性，提高定量分析的準確性，如何基于已知的靶多核苷酸序列設計出檢測更為靈敏的試劑盒成為了一個關鍵性的基本技術環節。

發明內容

為解決上述技術問題，本發明提供了一種新型冠狀病毒qRT-PCR一步法試劑盒反應液及其試劑盒和方法，以通過增強提高試劑盒的反應體系從而減少和避免檢測結果的假陰性或假陽性。

本發明的技術方案是：一種新型冠狀病毒qRT-PCR一步法試劑盒反應液，包括：PT-PCR反應液、酶混合液、Solution、特異性引物及探針；所述PT- PCR反應液由每反應份計包括：DTT 5～40mM、KCl 100～200mM、MgSO₄ 3～6mM、Tris-HCl 20～40mM；所述酶混合液由每反應份計包括：熱啟動Taq酶 5-8mM、MMLV逆轉錄酶3-4mM、RNA抑制劑10-15mM，dNTP 10mM，并通過酶保存液補足至4uL；所述Solution的配方由每反應份計為：(NH₄)₂SO₄ 20～40mM、吐溫20 1.8E^-6～3.6E^-6、三氮化鈉4.5E^-2～9E^-2、甘油0.05～0.1mM、二甲基亞砜0.07～0.14mM、牛血清蛋白1.5E^-7～3E^-7。

更進一步地，所述Solution配方還包括增強劑2.5％體積比，所述增強劑的制備方法為：將10mM Tris-HCl與1～1.5mM三辛基氧化磷、0.5～0.7mM鄰二氮菲、0.05～0.2mM甲酰胺混合，搖勻，得到增強劑。

本發明還公開了一種基于新型冠狀病毒qRT-PCR一步法試劑盒反應液的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒含有權利要求1或2的試劑盒反應液。

進一步地，所述試劑盒內的反應體系具體成分以每人份計包含：0.8uL RT- PCR反應液、4uL酶混合液、2.0uL 10×Solution、0.25uL正向引物、0.25uL 反向引物、0.2uL探針，0.4uL 2019-nCoV新型冠狀病毒模板，無菌水補足至 20uL；其中，所述正向引物、反向引物及探針的含量為所對應的2019-nCoV新型冠狀病毒基因、內參基因RPP30的引物及探針各半。

更進一步地，所述2019-nCoV新型冠狀病毒基因、內參基因RPP30的引物及探針的序列分別為：