[發(fā)明專(zhuān)利]新型冠狀病毒qRT-PCR一步法試劑盒反應(yīng)液及其試劑盒和方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202010316736.5
• 申請(qǐng)日: 2020-04-21
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN111621595A
• 公開(kāi)（公告）日: 2020-09-04
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 禹文峰;張遠(yuǎn)波;梁貴友;黃智;高睿;王碧
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 貴州醫(yī)科大學(xué)
• 主分類(lèi)號(hào): C12Q1/70
• 分類(lèi)號(hào): C12Q1/70;C12Q1/686;C12N15/11
• 代理公司: 北京棧橋知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11670
• 代理人: 潘衛(wèi)鋒

1.一種新型冠狀病毒qRT-PCR一步法試劑盒反應(yīng)液，其特征在于，包括：PT-PCR反應(yīng)液、酶混合液、Solution、特異性引物及探針；

所述PT-PCR反應(yīng)液由每反應(yīng)份計(jì)包括：DTT 5～40mM、KCl 100～200mM、MgSO₄ 3～6mM、Tris-HCl 20～40mM；

所述酶混合液由每反應(yīng)份計(jì)包括：熱啟動(dòng)Taq酶5-8mM、MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶3-4mM、RNA抑制劑10-15mM，dNTP 10mM，并通過(guò)酶保存液補(bǔ)足至4uL；

所述Solution的配方由每反應(yīng)份計(jì)為：(NH₄)₂SO₄ 20～40mM、吐溫20 1.8E^-6～3.6E^-6、三氮化鈉4.5E^-2～9E^-2、甘油0.05～0.1mM、二甲基亞砜0.07～0.14mM、牛血清蛋白1.5E^-7～3E^-7。

2.如權(quán)利要求1中所述一種新型冠狀病毒qRT-PCR一步法試劑盒反應(yīng)液，其特征在于，所述Solution配方還包括增強(qiáng)劑2.5％體積比，所述增強(qiáng)劑的制備方法為：將10mM Tris-HCl與1～1.5mM三辛基氧化磷、0.5～0.7mM鄰二氮菲、0.05～0.2mM甲酰胺混合，搖勻，得到增強(qiáng)劑。

3.一種基于新型冠狀病毒qRT-PCR一步法試劑盒反應(yīng)液的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒含有權(quán)利要求1或2的試劑盒反應(yīng)液。

4.如權(quán)利要求3所述的一種基于新型冠狀病毒qRT-PCR一步法試劑盒反應(yīng)液的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒內(nèi)的反應(yīng)體系具體成分以每人份計(jì)包含：0.8uL RT-PCR反應(yīng)液、4uL酶混合液、2uL 10×Solution、0.25uL正向引物、0.25uL反向引物、0.2uL探針，0.4uL2019-nCoV新型冠狀病毒模板，無(wú)菌水補(bǔ)足至20uL；其中，所述正向引物、反向引物及探針的含量為所對(duì)應(yīng)的2019-nCoV新型冠狀病毒基因、內(nèi)參基因RPP30的引物及探針各半，控制整個(gè)反應(yīng)體系pH在6.5～8.5。

5.如權(quán)利要求4所述的一種基于新型冠狀病毒qRT-PCR一步法試劑盒反應(yīng)液的試劑盒，其特征在于，所述2019-nCoV新型冠狀病毒基因、內(nèi)參基因RPP30的引物及探針的序列分別為：

1)2019-nCoV新型冠狀病毒基因(ORF1ab基因或N基因)

正向引物：SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:4；

反向引物：SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:5；

探針：SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:6；

2)內(nèi)參基因RPP30

正向引物：SEQ ID NO:7；

反向引物：SEQ ID NO:8；

探針：SEQ ID NO:9。

6.一種基于新型冠狀病毒qRT-PCR一步法試劑盒反應(yīng)液的試劑盒使用方法，其特征在于，包括以下步驟：

S1：從檢測(cè)樣本中提取病毒的RNA作為模板，使用權(quán)利要求4配制的試劑盒配置擴(kuò)增反應(yīng)體系，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增得到擴(kuò)增曲線(xiàn)；

S2：對(duì)所述擴(kuò)增曲線(xiàn)進(jìn)行分析判斷，得出檢測(cè)樣本中是否存在2019-nCoV新型冠狀病毒結(jié)論。

7.如權(quán)利要求6所述的一種基于新型冠狀病毒qRT-PCR一步法試劑盒反應(yīng)液的試劑盒使用方法，其特征在于，所述擴(kuò)增反應(yīng)體系的反應(yīng)參數(shù)及擴(kuò)增程序如下：

[1]42℃30min

[2]95℃5min

[3]94℃30sec

[4]60℃1min

[5]Go to[3]and[4]，40-45cycles，在第[4]步采集FAM通道熒光信號(hào)

[6]End。