[發明專利]一種表達大鼠β-防御素2的載體、乳酸乳球菌及其應用

在審

• 申請號: 202010316587.2
• 申請日: 2020-04-21
• 公開（公告）號: CN111500616A
• 公開（公告）日: 2020-08-07
• 發明（設計）人: 宗亞楠;吳長毅;張利萍;韓登陽;李正遷;郭向陽
• 申請（專利權）人: 北京大學第三醫院（北京大學第三臨床醫學院）
• 主分類號: C12N15/74
• 分類號: C12N15/74;C12N15/66;C12N1/21;A61K35/744;A61P31/04;A61P11/00;A61P1/00;C12R1/01
• 代理公司: 焦作加貝專利代理事務所(普通合伙) 41182
• 代理人: 馮新志

本發明公開了一種表達大鼠β?防御素2的載體，屬于生物醫學領域。所述載體是包含β?防御素2編碼核苷酸序列的pSEC表達載體。本發明還公開了所述表達大鼠β?防御素2的載體的構建方法。進一步地，本發明還公開了包含所述表達大鼠β?防御素2的載體的乳酸乳球菌及其在制備用于于治療膿毒癥的藥物中的應用。本發明的載體和重組乳酸乳球菌，不僅避免了病毒載體系統的不足，而且還能發揮乳酸菌自身的有益作用，從而為β?防御素2在防治膿毒癥性急性肺損傷及維持腸道屏障功能中的應用奠定堅實基礎。

技術領域

本發明屬于生物醫學領域，具體地，涉及一種表達大鼠β-防御素2的載體、乳酸乳球菌及其應用。

背景技術

膿毒癥（sepsis）指病原微生物經過各種途徑進入機體內而引發的全身炎癥反應綜合征（systemic inflammatory response syndrome，SIRS），是燒傷、創傷及外科術后常見的并發癥。膿毒癥患者常引起多器官功能受損，甚至出現多器官功能障礙綜合征（multiple organ dysfunction syndrome，MODS）。研究顯示，全球每年大約有3150萬人罹患膿毒癥，死亡人數高達500多萬。膿毒癥的確切發病機制尚不明確，其病理生理過程十分復雜，涉及多種細胞因子和炎性介質的誘導、合成與釋放以及免疫功能的改變，因而臨床治療非常棘手，病死率高達25%～30%。盡管目前針對膿毒癥所致MODS的發病機制及干預措施研究較多，但仍缺乏有效的治療措施，其病死率居高不下。因此，探索膿毒癥發生發展的病理生理機制和新的有效治療措施是當前研究的重點。

防御素（defensin）是體內一組具有抗微生物特性的小分子肽類，主要包括α-防御素、β-防御素、θ-防御素等，它們分布于體內不同器官系統，主要構成了先天性免疫的一部分。其中，β-防御素2（β-defensin-2，BD-2）是一種最重要的可誘導性防御素，廣泛分布于皮膚、呼吸系統、消化系統、子宮等部位。呼吸道和消化道的上皮細胞在細菌、病毒及炎性介質（如TNF-α、IL-1β）刺激下均可激活BD-2基因啟動區域轉錄因子，成倍地增加BD-2 mRNA表達，產生大量BD-2多肽分子。誘導產生的β-防御素2不僅具有明顯的殺滅病原微生物的作用，還可通過誘導T輔助淋巴細胞向Th2類細胞轉化或募集Th2類細胞，調節Th1/Th2細胞平衡，導致促炎細胞因子生成減少，抗炎細胞因子合成增多，從而增強機體抗感染免疫防御功能。反之，β-防御素2不表達或低水平表達則與某些臨床疾病(如先天性肺囊性纖維化、肺部感染及克隆病)的發生、發展密切相關。研究表明，重癥膿毒癥患者白細胞β-防御素2的轉錄水平明顯降低，而β-防御素2基因重組腺病毒轉染膿毒癥大鼠可顯著減輕其肺損傷程度、提高7d生存率。研究還顯示，直腸應用豬β-防御素2可維持腸道屏障功能，顯著減輕結腸炎小鼠腸道炎性損害。

由于β-防御素2表達在膿毒癥性急性肺損傷及維持腸道屏障功能中的重要作用，因此，促進β-防御素2的表達或補充外源性的β-防御素2均可減輕膿毒癥所致的器官損害，進而，采用基因工程技術補充外源性β-防御素2是防治膿毒癥所致肺、腸損害的一種有效措施。然而，β-防御素2基因需要通過一定的轉運系統即載體才能導入靶細胞。病毒（單純皰疹病毒、腺病毒及逆轉錄病毒）是基因工程技術常用的轉運系統。已有研究報道β-防御素2基因在腺病毒中表達，并且發現重組腺病毒通過增加β-防御素2表達顯著減輕膿毒癥性急性肺損傷。然而，β-防御素2病毒載體系統存在以下缺點：（1）基因轉化效率相對較低；（2）由于靶細胞選擇性清除、轉化基因或啟動子活性的消失導致基因表達時間短暫；（3）具有內在毒性，可誘發顯著的免疫反應。

發明內容

為了解決上述技術問題，本發明旨在提供一種新的表達載體，能夠用于防治膿毒癥急性肺損傷及維持腸道屏障功能。為此，

本發明一方面提供一種表達大鼠β-防御素2的載體，所述載體是包含β-防御素2編碼核苷酸序列的pSEC表達載體。