[發(fā)明專利]一種手性羥基酸酯的生物制備方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202010316359.5
• 申請(qǐng)日: 2020-04-21
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN111454998B
• 公開(kāi)（公告）日: 2023-05-02
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 于洪巍;賈衛(wèi)民;王之建;俞鑫焱;洪一鳴;程存照
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 黃山科宏生物香料股份有限公司
• 主分類號(hào): C12P7/62
• 分類號(hào): C12P7/62;C12N9/04;C12N15/70
• 代理公司: 安徽合肥華信知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 34112
• 代理人: 余成俊

本發(fā)明公開(kāi)了一種手性羥基酸酯的生物制備方法，包括以下步驟：（1）將脂肪酸經(jīng)酮化酶球形烯單氧酶氧化后生成4?氧代脂肪酸；（2）4?氧代脂肪酸經(jīng)短鏈脫氫酶PpYSDR?M85Q/L136A不對(duì)稱還原得到R?羥基酸酯。本發(fā)明手性羥基酸酯的生物制備方法通過(guò)構(gòu)建短鏈脫氫酶突變體，其較野生型對(duì)酮酸的活性、手性選擇性大幅提高能提高該酶在催化酮酸制備手性內(nèi)酯上的效率，以充分發(fā)掘其應(yīng)用價(jià)值，同時(shí)酶法合成手性羥基酸酯具有工藝簡(jiǎn)單、環(huán)境友好、效益高等特點(diǎn)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物化工技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種手性羥基酸酯的生物制備方法。

背景技術(shù)

手性化合物的兩種對(duì)映異構(gòu)體往往具有不同的功效或其作用效果相差甚遠(yuǎn)，因此，單一對(duì)映體的合成越來(lái)越受關(guān)注。光學(xué)活性手性內(nèi)脂被廣泛應(yīng)用于手性天然香料。傳統(tǒng)化學(xué)合成具有難度大、污染大的特點(diǎn)。脂肪酸經(jīng)酮化酶氧化可得到酮酸。酮酸的不對(duì)稱還原是制備光學(xué)活性手性羥基酸的重要方法，理論上能將?100％底物酮酸轉(zhuǎn)化為單一對(duì)映體的手性羥基酸，具有很高的工業(yè)應(yīng)用價(jià)值。?與化學(xué)法不對(duì)稱還原相比，生物法催化法在化學(xué)選擇性、區(qū)域選擇性和立體選擇性方面更具優(yōu)勢(shì)，產(chǎn)物光學(xué)純度高；此外，生物催化通常在溫和條件下進(jìn)行，避免了劇烈化學(xué)反應(yīng)過(guò)程中化合物的異構(gòu)化、差向異構(gòu)化、消旋和重排等現(xiàn)象的發(fā)生。因此，生物催化法合成光學(xué)活性手性內(nèi)脂已成為最受矚目的醫(yī)藥及精細(xì)化學(xué)品的綠色合成技術(shù)之一。

在具有催化不對(duì)稱還原潛手性內(nèi)脂活性的酶中，短鏈脫氫酶由于其催化底物譜廣、熱穩(wěn)定性好以及有機(jī)溶劑耐受性強(qiáng)等特點(diǎn)而倍受關(guān)注。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明目的就是為了彌補(bǔ)已有技術(shù)的缺陷，提供一種手性羥基酸酯的生物制備方法，兩步酶法實(shí)現(xiàn)R-羥基酸酯的生物制備。

為了實(shí)現(xiàn)上述的目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案：

一種手性羥基酸酯的生物制備方法，包括以下步驟：

（1）將脂肪酸經(jīng)酮化酶球形烯單氧酶氧化后生成4-氧代脂肪酸；

（2）4-氧代脂肪酸經(jīng)短鏈脫氫酶PpYSDR-M85Q/L136A不對(duì)稱還原得到R-羥基酸酯。

進(jìn)一步的，所述短鏈脫氫酶PpYSDR-M85Q/L136A由野生型短鏈脫氫酶PpYSDR經(jīng)突變改造制得。

進(jìn)一步的，所述野生型短鏈脫氫酶PpYSDR經(jīng)突變改造制得短鏈脫氫酶PpYSDR-M85Q/L136A的步驟如下：

（1）突變體的構(gòu)建：以含有突變點(diǎn)的寡核苷酸片段為引物分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，擴(kuò)增含有PpYSDR基因的pET-30a重組質(zhì)粒得到單點(diǎn)突變體后，再以該突變體的重組質(zhì)粒為模板，另一突變體為引物，構(gòu)建兩點(diǎn)組合突變體；

（2）短鏈脫氫酶突變體的誘導(dǎo)表達(dá)：將步驟1中構(gòu)建的工程菌接種至50μg/mL卡那霉素的?LB培養(yǎng)基中，37℃，200rpm培養(yǎng)過(guò)夜，再以1%接種量（v/v）接種至含50μg/mL卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，37℃，200rpm培養(yǎng)至菌體濃度OD600至0.6左右，加入終濃度為0.1mMIPTG，26℃誘導(dǎo)培養(yǎng)6h后，4℃、8000rpm離心10min收集菌體，-80℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

進(jìn)一步的，所述步驟1中構(gòu)建突變體所使用的基因工程菌為大腸桿菌，優(yōu)選為E.coli?BL21(DE3)大腸桿菌。

進(jìn)一步的，所述步驟1中構(gòu)建突變體所使用的基因工程菌菌體的質(zhì)量用量以菌體濕重計(jì)為50-300g/L。

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是：

常規(guī)短鏈脫氫酶在催化酮酸（如4-氧代十酸甲酯、4-氧代十一酸甲酯）活性較低，本發(fā)明手性羥基酸酯的生物制備方法通過(guò)構(gòu)建短鏈脫氫酶突變體，其較野生型對(duì)酮酸的活性、手性選擇性大幅提高能提高該酶在催化酮酸制備手性內(nèi)酯上的效率，以充分發(fā)掘其應(yīng)用價(jià)值，同時(shí)酶法合成手性羥基酸酯具有工藝簡(jiǎn)單、環(huán)境友好、效益高等特點(diǎn)。

具體實(shí)施方式