[發明專利]尖孢鐮刀菌苦瓜專化型LAMP可視化檢測方法及其試劑盒

在審

• 申請號: 202010315335.8
• 申請日: 2020-04-21
• 公開（公告）號: CN111304357A
• 公開（公告）日: 2020-06-19
• 發明（設計）人: 黃熊娟;黃如葵;陳振東;秦健;馮誠誠;陳小鳳;琚茜茜;黃玉輝;梁家作;劉杏連;莫春梅
• 申請（專利權）人: 廣西壯族自治區農業科學院
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12Q1/6844;C12Q1/04;C12N15/11;C12R1/77
• 代理公司: 廣西南寧公平知識產權代理有限公司 45104
• 代理人: 楊立華

本發明公開了尖孢鐮刀菌苦瓜專化型LAMP可視化檢測引物組，包括引物FoM?F3?1和引物FoM?B3?1、引物FoM?FIP?1和引物FoM?BIP?1。據此，發明研制了相應試劑盒并建立了相應檢測方法。應用本發明無需電泳和紫外觀察等步驟，只需水浴鍋或恒溫箱反應60min，即可通過肉眼觀察顏色變化即可判定結果，靈敏度可達5.6pg/μL。本發明為解決尖孢鐮刀菌苦瓜專化型早期的快速檢測，提供了一種LAMP可視化檢測方法，其靈敏度高、特異性好，能準確鑒定植株、種子等上的尖孢鐮刀菌苦瓜專化型，而且高效、快速、便捷、低成本、易操作，適合基層快速診斷，對苦瓜枯萎病的早期診斷和有效防控的具有重要意義。

技術領域

本發明屬于LAMP檢測技術領域，尤其涉及一種尖孢鐮刀菌苦瓜專化型LAMP可視化檢測方法及其試劑盒。

背景技術

尖孢鐮刀菌苦瓜專化型(Fusarium oxysporum f.sp.momordicae nov.f.)，屬半知菌亞門真菌，是苦瓜枯萎病的病原菌。病菌以厚垣孢子或菌絲體在土壤、肥料中越冬，成為翌年主要初侵染源，病部產生的大、小分生孢子通過灌溉水或雨水飛濺，從植株地上部的傷口侵入，并進行再侵染。連作地或施用未充分腐熟的土雜肥，地勢低洼、植株根系發育不良，天氣濕悶發病重。由于常年連作，苦瓜枯萎病已成為苦瓜生產中主要病害，并有迅速蔓延的趨勢。目前，對于苦瓜枯萎病尚未發現很好的特效藥，主要以預防為主，在發病前或發病初期使用異菌脲、甲基硫菌靈、五氯硝基苯、多菌靈、惡霉靈、百菌清等化學藥劑進行防治，發病中后期藥劑對枯萎病基本無明顯效果，導致嚴重的經濟效益損失。因此，早期快速檢測尖孢鐮刀菌苦瓜專化型的方法尤為重要，可為苦瓜枯萎病的防治贏得寶貴時間。

環介導等溫擴增技術(LAMP，Loop-mediated isothermal amplification)，是2000年日本學者Notomi在Nucleic Acids Res雜志上公開了一種新的適用于基因診斷的恒溫核酸擴增技術。該技術已成功地應用于SARS、禽流感、HIV等病毒、細菌、寄生蟲疾病的檢測中，通過早期快速診斷對防止病癥快速蔓延起到了積極作用。LAMP技術具有高特異性、高靈敏度的優點，而且操作十分簡單，對儀器設備要求低，一臺水浴鍋或恒溫箱就能實現反應，結果的檢測也很簡單，不需要像PCR那樣進行凝膠電泳，環介導等溫擴增反應的結果通過肉眼觀察白色渾濁或綠色熒光的生成來判斷，簡便快捷，適合基層快速診斷。

目前，尖孢鐮刀菌的檢測通常采用傳統的形態特征鑒定方法、普通PCR檢測法、real-time PCR檢測法等。陳振東等公開了尖孢鐮刀菌苦瓜專化型的RAPD標記和由該標記轉化得到的SCAR標記以及這些分子標記在病原菌鑒別及發病組織檢測中的應用；李欣等建立了尖孢鐮刀菌的SYBR Green Ⅰ熒光定量PCR檢測方法；劉迪秋等發明了一種三七根腐病致病菌尖孢鐮刀菌的Real-time PCR檢測引物及檢測方法；車團結等發明了一種用于檢測尖孢鐮刀菌的核苷酸序列組；曹月霞尖建立了孢鐮刀菌西瓜專化型分子檢測技術。然而，這些檢測方法均要使用昂貴的儀器設備，如PCR儀、熒光定量PCR儀等，而且其程序繁瑣，不適于一些資源有限的實驗室和生產上的基層工作者。

尖孢鐮刀菌種內存在顯著的遺傳分化，如營養體親和群(VCG)、生理小種或專化型。因此，利用LAMP技術鑒別不同專化型的尖孢鐮刀菌時，需要尋找并發現不同專化型的特異性片段序列，并針對其設計特異性、靈敏度優良的特異性引物，才能實現準確識別和鑒定不同專化型尖孢鐮刀菌，這對種內分離物之間的基因組序列同源性相當高的尖孢鐮刀菌種而言要求非常高。因此，目前利用LAMP技術進行尖孢鐮刀菌檢測的研究報道很少，鄧晟發明了基于Lamp技術對尖孢鐮刀菌蓮專化型病原菌的檢測方法；楊雷亮等發明了一種同時檢測尖孢鐮刀菌古巴專化型1號與4號小種的LAMP方法。然而，尖孢鐮刀菌苦瓜專化型LAMP檢測技術尚未見報道。

發明內容

本發明要解決的技術問題是提供一種靈敏度高、特異性強、準確性好且高效快捷、經濟實用的尖孢鐮刀菌苦瓜專化型LAMP可視化檢測方法及其試劑盒。