[發(fā)明專利]一種高效形成環(huán)狀RNA的過(guò)表達(dá)載體pCircleVG及其構(gòu)建方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202010302212.0
• 申請(qǐng)日: 2020-04-16
• 公開（公告）號(hào): CN111378686B
• 公開（公告）日: 2020-11-10
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 陳英;吳向萍;郭學(xué)雙;于蒙蒙
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 山東維真生物科技有限公司
• 主分類號(hào): C12N15/85
• 分類號(hào): C12N15/85;C12N15/65;C12N15/66
• 代理公司: 廣州科沃園專利代理有限公司 44416
• 代理人: 張帥;陸豐艷

本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種高效形成環(huán)狀RNA的過(guò)表達(dá)載體pCircleVG及其構(gòu)建方法。本發(fā)明提供的過(guò)表達(dá)載體pCircleVG，由在CAG啟動(dòng)子的下游加入了反向互補(bǔ)的序列和內(nèi)含子，之后是5’的剪接受體和編碼GFP C端的DNA序列，之后是一段polyA的信號(hào)序列，然后是翻譯起始的kozak序列，和編碼GFP N端的DNA序列，最后是3’的剪接供體，內(nèi)含子和反向互補(bǔ)序列。本發(fā)明提供的過(guò)表達(dá)載體pCircleVG，通過(guò)加強(qiáng)RNA分子的反向剪切，提高了外源表達(dá)環(huán)狀RNA的效率與水平。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種高效形成環(huán)狀RNA的過(guò)表達(dá)載體pCircleVG及其構(gòu)建方法。

背景技術(shù)

環(huán)狀RNA是一類新發(fā)現(xiàn)的RNA。與線性的RNA不同，環(huán)狀RNA首尾通過(guò)磷酸酯鍵連接形成閉合的環(huán)狀。大多數(shù)的環(huán)狀RNA都是由于外顯子的反向剪接而形成的。隨著高通量測(cè)序技術(shù)的廣泛應(yīng)用，大量的環(huán)狀RNA被發(fā)現(xiàn)存在于真核生物的轉(zhuǎn)錄組中。由于環(huán)狀RNA的特殊結(jié)構(gòu)，一般認(rèn)為，環(huán)狀RNA具有不易降解的特性。環(huán)狀RNA被認(rèn)為具有很多潛在的功能，例如：它們可以與細(xì)胞內(nèi)的microRNA結(jié)合，從而阻止microRNA與其目標(biāo)RNA的結(jié)合，從而調(diào)節(jié)microRNA的功能；環(huán)狀RNA也被報(bào)道有幫助RNA蛋白復(fù)合體組裝的功能；其它可能的功能也可能包括基因表達(dá)調(diào)控，RNA剪接等。這些基本的生物學(xué)功能，使得環(huán)狀RNA在胚胎發(fā)育，神經(jīng)退行性疾病，癌癥的發(fā)生與轉(zhuǎn)移過(guò)程中都起到非常重要的作用。

雖然環(huán)狀RNA的潛在功能非常廣泛，但對(duì)于它的生成機(jī)理，分子特性，以及功能的研究才剛剛開始。阻礙這方面研究進(jìn)展的一個(gè)關(guān)鍵就在于沒(méi)有一個(gè)有效地模仿細(xì)胞內(nèi)環(huán)境，可以高效地，可重復(fù)地，穩(wěn)定生成環(huán)狀RNA的過(guò)表達(dá)系統(tǒng)。一般認(rèn)為，環(huán)狀RNA的形成是由于RNA的反向剪接而形成的。真核生物的RNA前體(preRNA)通常包含有外顯子(Exon)和內(nèi)含子(Intron)，只有在細(xì)胞核內(nèi)，RNA剪接復(fù)合體識(shí)別外顯子3’端剪接供體與下一個(gè)外顯子5’端的剪接受體，通過(guò)一系列的反應(yīng)而除內(nèi)含子，將多個(gè)外顯子連接起來(lái)才能形成有功能的成熟的mRNA.并轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞核外進(jìn)行翻譯。而反向剪接的具體的機(jī)理可能是由于具有環(huán)化可能的外顯子兩端的內(nèi)含子中存在有可以形成互補(bǔ)結(jié)合結(jié)構(gòu)的序列，從而將位于外顯子5’端的剪接受體與同一外顯子3’端的剪接供體在空間上拉近，從而使得反向剪接成為可能。與順式剪切的高效性不同，反向剪切的效率是比較低的。目前廣泛使用的過(guò)表達(dá)系統(tǒng)模仿了細(xì)胞內(nèi)的反向剪切，但為了提高效率，通常是通過(guò)延長(zhǎng)內(nèi)含子中形成互補(bǔ)結(jié)構(gòu)的序列來(lái)實(shí)現(xiàn)的。但較長(zhǎng)的互補(bǔ)序列導(dǎo)致了過(guò)表達(dá)的RNA與細(xì)胞內(nèi)其他RNA的非特異性結(jié)合，而且即使在這樣的條件下，RNA的環(huán)化效率仍然很低。這樣的表達(dá)體系，約20-40％的表達(dá)的RNA會(huì)形成環(huán)狀RNA。所以構(gòu)建一種具有短的，高度特異性的互補(bǔ)結(jié)合序列，而且有高的剪切效率的過(guò)表達(dá)系統(tǒng)將會(huì)極大地促進(jìn)環(huán)狀RNA的機(jī)理與功能研究。

在各種生物系統(tǒng)中，病毒的基因組是最高效地組合在一起的。病毒利用各種的RNA轉(zhuǎn)錄，剪切，和翻譯調(diào)控來(lái)達(dá)到在有限的基因組中編碼多種蛋白，以滿足病毒轉(zhuǎn)錄，復(fù)制，翻譯和形成新的病毒顆粒的需求。相比其他細(xì)胞體系，病毒在各個(gè)方面都是非常高效的。在分子生物學(xué)中我們常用的一些真核生物的表達(dá)控制元件都來(lái)自于病毒。如啟動(dòng)子有CMV，RSV，SV40等。我們因此試圖在病毒中找到一種類似于反向剪接的體系，但很遺憾的是尚未有這方面的報(bào)道。似乎環(huán)狀RNA是真核生物特有的。但我們知道病毒中的剪接元件是非常高效的。而且在某些真核生物病毒具有一種特異的剪接方式，反式剪接(Trans Splicing)。反式剪接(Trans Splicing)與反向剪接(Reverse Splicing)有很多類似性。反式剪接發(fā)生在兩個(gè)RNA分子之間。它的發(fā)生也需要有內(nèi)含子中的反向互補(bǔ)結(jié)構(gòu)的形成連接，將要剪接的兩個(gè)RNA分子在空間上拉近，從而實(shí)現(xiàn)一個(gè)RNA分子的外顯子的3’剪接供體與另一個(gè)RNA分子的外顯子的5’剪接受體之間發(fā)生剪接。有關(guān)順式剪接的結(jié)構(gòu)如圖1所示，反式剪接的結(jié)構(gòu)如圖2所示，反向剪接的結(jié)構(gòu)如圖3所示。

發(fā)明內(nèi)容