[發明專利]負載CpG ODN免疫佐劑的聚多巴胺納米顆粒制備方法

在審

• 申請號: 202010224457.6
• 申請日: 2020-03-26
• 公開（公告）號: CN111617055A
• 公開（公告）日: 2020-09-04
• 發明（設計）人: 常津;段玥;武曉麗;楊涵;高俊瀟;魏道河;張越
• 申請（專利權）人: 天津大學
• 主分類號: A61K9/51
• 分類號: A61K9/51;A61K47/34;A61K39/39;A61K41/00;A61K47/54;A61K47/69;A61P35/00;A61P35/04
• 代理公司: 天津市北洋有限責任專利代理事務所 12201
• 代理人: 程小艷

本發明公開一種負載CpG ODN免疫佐劑的聚多巴胺納米顆粒制備方法，利用多巴胺鹽酸鹽為原料，通過調整多巴胺鹽酸鹽濃度比例及反應時間與溶液PH，以及優選CpG ODN溶液濃度充分控制顆粒粒徑的大小以及載藥率，之后在表面修飾葉酸作為靶向功能團，最終制備出粒徑在100～150納米的顆粒，載藥率為30％，并測試該納米粒子的穩定性。

技術領域

本發明涉及納米醫藥技術領域，更具體的是涉及一種負載CpG ODN免疫佐劑的聚多巴胺納米顆粒制備方法，并且在表面修飾葉酸作為靶向功能團。

背景技術

目前為止腫瘤免疫治療已成為最強大的技術治療癌癥；然而，免疫逃避以及腫瘤組織微環境刺激免疫反應信號的缺乏極大的限制了免疫治療的效率。近年來，基于納米顆粒光熱免疫聯合療法顯示出強大的功效，借助納米平臺建立一種快速、精準的聯合治療系統，將光熱治療和免疫治療聯合，不僅可以有效地控制腫瘤發展，而且大大增強了其抗癌效率。

聚多巴胺顆粒具有較好的近紅外吸收能力，較強的光熱轉化效率，較好的生物安全性和生物安全性，表面超強附著的特性，這些特性使聚多巴胺成為光熱治療和免疫治療聯合治療納米平臺。CpG ODN是具有未甲基化的胞嘧啶磷酸鳥嘌呤基序的寡脫氧核苷酸，是非常流行且廉價的免疫佐劑。它們被Toll樣受體9(TLR9)識別，在鼠和人漿細胞樣樹突狀細胞(DC)中廣泛表達，并啟動先天性和適應性反應的信號級聯反應。利用聚多巴胺顆粒負載免疫佐劑CpG ODN，并修飾葉酸靶向。通過尾靜脈注射到荷瘤小鼠中，由于EPR效應及葉酸的靶向作用，納米顆粒滯留在腫瘤組織中，用808激光照射腫瘤部位，聚多巴胺的光熱效應誘導癌細胞產生免疫原性的細胞死亡，腫瘤細胞中鈣網蛋白和磷脂酰絲氨酸酸外翻到細胞表面，暴露“eat me”信號，與此同時CpG ODN在腫瘤部位緩解免疫抑制，有利于DC細胞向腫瘤部位的遷徙及成熟，之后CpG ODN可以持續刺激促炎細胞因子的分泌和樹突細胞的成熟，從而產生在腫瘤部位T淋巴細胞的活化和浸潤。促進CTL誘導腫瘤凋亡，與此同時記憶T細胞的生成，可以抑制腫瘤的轉移和長期復發。

發明內容

本發明的目的在于克服現有技術的不足，提出了一種具有粒徑小，細胞毒性小，具有靶向作用的聚多巴胺顆粒的制備方法。

本發明的技術方案：一種負載CpG ODN免疫佐劑的聚多巴胺納米顆粒制備方法，利用多巴胺鹽酸鹽為原料，通過調整多巴胺鹽酸鹽濃度比例及反應時間與溶液PH，以及優選CpG ODN溶液濃度充分控制顆粒粒徑的大小以及載藥率，之后在表面修飾葉酸作為靶向功能團，最終制備出粒徑在100～150納米的顆粒，載藥率為30％，并測試該納米粒子的穩定性。

具體如下：

1)將多巴胺鹽酸鹽溶于雙蒸水中，制備成為濃度為0.5～5.0mg/mL多巴胺水溶液，超聲

5min使其分布均勻

2)調節溶液的PH值為8～11，30～50℃條件下攪拌反應2～5h；

3)待反應結束,用15000rpm，15min離心，除去多余的多巴胺，得到黑色的聚多巴胺納米顆粒；

4)2.0mg/mL的聚多巴胺水溶液與100～1000μg/mL濃度的CpG ODN溶液攪拌孵育1～3h，離心去除多余的CpG ODN，得到負載CpG ODN免疫佐劑聚多巴胺納米顆粒。

5)將負載CpG ODN免疫佐劑的聚多巴胺納米顆粒重懸于含有葉酸的Tris緩沖液(10μmM，pH 8.5)中。在室溫下持續攪拌下孵育1h后，將功能化的納米顆粒離心并用雙蒸餾水洗滌3次。

評估本發明制備的負載CpG ODN免疫佐劑的聚多巴胺納米顆粒的載藥效果的方法如下：