[發(fā)明專利]一種納米開關(guān)分子及其控制激活的實(shí)體瘤靶向性CAR-T細(xì)胞

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202010219298.0
• 申請日: 2020-03-25
• 公開（公告）號: CN111358956B
• 公開（公告）日: 2021-07-09
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李茹恬;劉寶瑞
• 申請（專利權(quán)）人: 南京鼓樓醫(yī)院
• 主分類號: A61K47/62
• 分類號: A61K47/62;A61K47/60;A61K47/59;A61K9/14;A61K31/365;A61K31/436;A61K39/00;A61P35/00;C12N5/10;C12N15/867
• 代理公司: 南京鐘山專利代理有限公司 32252
• 代理人: 王磊

本發(fā)明公開了一種納米開關(guān)分子及其控制激活的實(shí)體瘤靶向性CAR?T細(xì)胞，實(shí)體瘤靶向性CAR?T細(xì)胞通過以下步驟制備：1）制備納米開關(guān)分子：采用雙乳化?揮發(fā)法使開關(guān)分子負(fù)載于腫瘤靶向性納米粒子上；2）構(gòu)建組裝型CAR?T質(zhì)粒：用基因重組法將T2A元件、FRB、FKBP序列及靶向?qū)嶓w瘤的ScFv段導(dǎo)入CAR?T質(zhì)粒中；3）制備組裝型CAR?T細(xì)胞：將組裝型CAR?T質(zhì)粒轉(zhuǎn)染T淋巴細(xì)胞；4）制備實(shí)體瘤靶向性CAR?T細(xì)胞：組裝型CAR?T細(xì)胞胞吞納米開關(guān)分子。本發(fā)明通過使用瘤靶向性納米粒子負(fù)載開關(guān)分子，可以使開關(guān)分子特異性聚集于腫瘤組織，通過開關(guān)分子連接CAR?T的FKBP和FRAP，使CAR?T的兩部分結(jié)合而具有攻擊活性，可從根本上解決CAR?T細(xì)胞脫靶效應(yīng)的問題。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于腫瘤免疫學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種納米開關(guān)分子及其控制激活的實(shí)體瘤靶向性CAR-T細(xì)胞。

背景技術(shù)

CAR-T療法(Chimeric Antigen Receptor T-Cell Immunotherapy，嵌合抗原受體T細(xì)胞免疫療法)在白血病治療中取得了重大突破，為特定血液腫瘤患者帶來了新的希望。但是CAR-T療法在應(yīng)用于實(shí)體瘤時(shí)卻面臨了阻礙，其中最關(guān)鍵的原因在于目前實(shí)體瘤CAR-T的靶點(diǎn)在正常組織中都有少量表達(dá)，因此CAR-T可以非特異性攻擊正常組織造成嚴(yán)重的脫靶效應(yīng)，已有相關(guān)死亡案例。

CAR-T細(xì)胞的制備方法是將CAR基因質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入T淋巴細(xì)胞使之成為CAR-T細(xì)胞，轉(zhuǎn)染方法包括病毒轉(zhuǎn)染和電穿孔轉(zhuǎn)染法。病毒轉(zhuǎn)染法是用慢病毒或逆轉(zhuǎn)錄病毒感染細(xì)胞，使之表達(dá)相應(yīng)基因；電穿孔法是用轉(zhuǎn)座子或者轉(zhuǎn)座酶系統(tǒng)對CAR基因進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)座子是一段DNA序列能夠通過轉(zhuǎn)座酶切割和插入，CAR基因序列可以插入到質(zhì)粒的轉(zhuǎn)座子上，質(zhì)粒在T細(xì)胞活化之前電轉(zhuǎn)到T細(xì)胞中，之后轉(zhuǎn)座酶切割含有CAR的轉(zhuǎn)座子，然后插入到T細(xì)胞的基因組中。使用轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)比起電轉(zhuǎn)方式能夠改善基因轉(zhuǎn)染的效率，轉(zhuǎn)染效率接近病毒轉(zhuǎn)染。

控制實(shí)體瘤CAR-T脫靶效應(yīng)的主要思路包括：1、尋找新靶點(diǎn)或設(shè)計(jì)CAR-T細(xì)胞的多靶點(diǎn)激活：理想的CAR-T靶點(diǎn)應(yīng)滿足①位于腫瘤細(xì)胞表面②在特定腫瘤細(xì)胞表面高表達(dá)③在正常組織中不表達(dá)，但目前尚未找到完全符合上述要求的實(shí)體瘤特異性表面抗原；2、控制CAR-T失活，包括導(dǎo)入單純皰疹病毒胸苷激酶(HSV-tk)、Fas胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域(ΔFAS)、iCasp9等人工合成的死亡控制開關(guān)，但上述方法均未能從根本上解決CAR-T非特異性激活的問題，并且復(fù)雜的CAR-T設(shè)計(jì)導(dǎo)致為生產(chǎn)制備及大規(guī)模臨床應(yīng)用造成了困難。

高分子納米粒子系指粒徑在1-1000nm范圍內(nèi)的高分子粒子，其構(gòu)成材料為具有生物相容性的高分子材料，可在水溶液中構(gòu)成穩(wěn)定的粒徑1000nm以下的粒子及負(fù)載小分子藥物，如脂質(zhì)體(liposome)、聚乳酸(Poly(lactic acid)，PLA)、聚乳酸-羥基乙酸共聚物(poly(lactic-co-glycolic acid)，PLGA)、聚己內(nèi)酯(Polycaprolactone,PCL)、殼聚糖(chitosan)、環(huán)糊精(Cyclodextrin)等，以及上述高分子經(jīng)其他高分子修飾后形成的復(fù)合高分子，如聚乙二醇(Polyethylene glycol,PEG)、單甲氧基聚乙二醇(Methoxypolyethylene glycol)和聚N-異丙基丙烯酰胺(poly(N-isopropylacrylamide))等。

開關(guān)分子是異二聚體小分子配體，包括赤霉素、雷帕霉素及其衍生物，可連接兩個(gè)不同結(jié)構(gòu)域使其二聚化以調(diào)節(jié)生物過程，其中，雷帕霉素衍生物AP21967(A/CHeterodimerizer)有兩個(gè)結(jié)合表面：一個(gè)與FKBP12結(jié)合，另一個(gè)與mTor/FRAP的Frb結(jié)構(gòu)域結(jié)合。腫瘤靶向性納米載體(高分子納米粒子)可負(fù)載開關(guān)分子，負(fù)載方法包括納米沉淀法、乳化法、等電點(diǎn)法及藥物負(fù)載法等，腫瘤靶向性納米載體包括明膠酶靶向納米粒子、磁靶向納米粒子、熱靶向納米粒子和環(huán)境響應(yīng)靶向納米粒子，其中明膠酶靶向納米粒子已被前期工作反復(fù)證實(shí)可以將所負(fù)載的藥物靶向投遞到腫瘤組織。