[發明專利]檢測新型冠狀病毒的引物組合物和檢測方法

在審

• 申請號: 202010215837.3
• 申請日: 2020-03-24
• 公開（公告）號: CN111621592A
• 公開（公告）日: 2020-09-04
• 發明（設計）人: 吳濤
• 申請（專利權）人: 吳濤
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/6844;C12N15/11;C12R1/93
• 代理公司: 北京酷愛智慧知識產權代理有限公司 11514
• 代理人: 劉娟

本發明公開了一種檢測新型冠狀病毒的引物組合物和檢測方法，具體公開了利用環介導等溫擴增技術檢測新型冠狀病毒的方法，其以新型冠狀病毒全基因組中的ORF1ab基因和N基因為靶基因，通過設計特異性引物，優化反應體系，進行目的基因的擴增，具有操作簡單、效率高和成本低的特點。本發明用于檢測新型冠狀病毒具有特異性強、方便快捷的特點，能夠提高檢測效率，能夠滿足基層實驗室的檢測要求，為檢測新型冠狀病毒提供了新的方法。

技術領域

本發明涉及病毒檢測技術領域，具體涉及一種檢測新型冠狀病毒的引物組合物和檢測方法。

背景技術

目前，新型冠狀病毒(以下簡稱SARS-CoV-2)核酸陽性是COVID-19確診最為權威和直接的病原學證據，其檢測主要依賴于實時熒光RT-PCR技術和基因測序平臺實現。但是，無論是通過實時熒光PCR平臺，還是基因測序平臺進行SARS-CoV-2核酸檢測，都需要醫療機構或檢測機構配備價格高昂的精密儀器(PCR分析儀和基因測序儀)、完備的實驗室條件以及經過嚴格培訓的專業技術人員。也正是受上述條件的限制，現行的SARS-CoV-2核酸檢測技術并不能在基層醫療機構中廣泛開展，也不能下沉到大多數具有生物安全二級實驗室和三級個人防護能力的醫療機構和檢測機構。因此，我們亟需一種不依賴精密儀器、靈敏度高、操作簡便且價格低廉的現場快速檢測(Point-of-Care Testing, POCT)試劑盒，此類臨床檢測試劑盒必將加快COVID-19的篩查和診斷，對于加強對傳染源的控制、降低發病率以及更好地控制疫情的蔓延等具有重要意義。

近年來，環介導等溫擴增技術(Loop-mediated isothermal amplification)在感染性疾病病原體核酸檢測中的應用備受關注，其針對靶基因序列設計8對特異性引物(如圖1所示)，其中F1c和F2組成上游內部引物FIP(Forward Inner Primer)，B1c和B2組成下游外部引物BIP(Backward Outer Primer)，上游環引物LF(Loop Forward)和下游環引物LB(Loop Backward)組成環引物對。

通常，F3、B3、FIP、BIP和環引物等3對引物在具有復制活性和高度鏈置換活性的DNA聚合酶的作用下，在60–65℃的恒定溫度下實現對靶基因序列6 個區域的快速特異性擴增。

發明內容

針對現有技術中的缺陷，本發明提供了檢測新型冠狀病毒的引物組合物和檢測方法。

為了實現上述目的，本發明采用了如下的技術方案：

本發明提供了檢測新型冠狀病毒的引物組合物，包括通過環介導等溫擴增技術檢測新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)的引物組，所述引物組包括核苷酸序列為SEQ ID NO:1、SEQID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、 SEQ ID NO:6的引物組和/或核苷酸序列為SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12的引物組。

本發明還提供了上述的引物組合物在制備檢測新型冠狀病毒的試劑盒中的應用。具體地，該試劑盒檢測的靶序列為新型冠狀病毒ORF1ab基因和N基因的保守區域。

本發明提供了一種檢測新型冠狀病毒的試劑盒，包括按照比例混合的權利要求1所述的引物組合物。具體地，ORF1ab環介導等溫擴增內引物﹕外引物﹕環引物終濃度之比為2.0﹕0.2﹕0.6，N基因環介導等溫擴增內引物﹕外引物﹕環引物終濃度之比為2.4﹕0.2﹕0.6。

進一步地，所述試劑盒還包括環介導等溫擴增反應試劑、陽性對照標本和陰性對照標本。

進一步地，所述試劑盒還包括一定比例的氯化錳和鈣黃綠素，以實現在日光或紫外燈下通過肉眼直接觀察反應管顏色變化判定結果。