[發明專利]一種土壤中放線菌原位培養的方法

在審

• 申請號: 202010197468.X
• 申請日: 2020-03-19
• 公開（公告）號: CN111254097A
• 公開（公告）日: 2020-06-09
• 發明（設計）人: 郭飛;木沙江·托乎提;馬正海;張民偉;牛麗娟;茍漁;林富順
• 申請（專利權）人: 新疆大學
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12R1/04
• 代理公司: 西安亞信智佳知識產權代理事務所(普通合伙) 61241
• 代理人: 段國剛

本發明公開了一種土壤中放線菌原位培養的方法，通過土壤樣品2025份和培養基225份混合滅菌，制備培養基質，后對250份土樣進行稀釋后，倒板培養，可以得到由單個放線菌個體生長而成菌落，建立了一種放線菌有效分離方法，該方法可在保證獲得絕大部分放線菌資源信息的情況下、有效減少工作量；且該方法中對土樣沒有進行熱處理、化學處理、添加抗生素等方法，去除環境中占優勢但非目標菌株，因此避免了常規方法中易破壞微生物生態環境，實現了放線菌的原位培養,增加了可培養放線菌數量，在放線菌分離技術上取得重要進展，在放線菌資源的保護和發展方面具有廣泛的適用性。

技術領域

本發明涉及微生物培養技術領域，具體的，本發明涉及一種土壤中放線菌原位培養的方法技術領域。

背景技術

放線菌(Actinomyces)是具有分枝狀菌絲體的革蘭陽性菌，放線菌可作為抗生素、維生素、酶和酶抑制劑的產生菌，是一類具有重要經濟價值和多種用途的微生物。但目前人們分離到的放線菌僅占土壤中所有放線菌的10％左右。而自然界中，絕大多數都是通過傳統培養方法無法分離得到的未培養微生物。尋找適用于放線菌的分離方法是挖掘未培養微生物資源，發現放線菌新種屬和新活性物質產生菌的重要途徑之一,開發新的微生物培養技術在增加微生物的可培養率、理解微生物在環境中功能以及實現資源利用方面具有重要意義。

目前，關于未培養微生物的研究方法雖較多，但由于對未培養微生物“不可培養性”的認識不足，也存在一些缺點：①培養基富營養化，一般認為，大多數微生物生活在寡營養環境中，突然的高濃度營養物質會阻礙微生物的生長；②生長因子缺乏；③在微生物傳統分離過程中常采用熱處理、化學處理、添加抗生素等方法，以去除環境中占優勢但非目標菌株，這樣的分離容易破壞微生物生態環境；④忽視微生物間的互作關系，當培養環境從天然生境突變到實驗室時，種間的信息交流會發生變化，傳統的單細胞培養方法使得微生物群體濃度降低甚至沒有，細胞保持“沉睡”狀態，無法釋放調節信號來抵御環境壓力。

近年來，在微生物培養技術以增加微生物的可培養率、理解微生物在環境中功能以及實現資源利用方面的重視，原位培養技術應用而生。原位培養就是在人工培養條件下，將環境微生物放置于擴散室中并使其溫育在這些微生物的棲息環境中實現控制。裝置中的微生物細胞無法向外擴散，但細胞能夠和自然環境建立化學交流，滿足細胞之間的相互聯系，將難培養的微生物轉變成可培養的微生物，從而實現對微生物生長的控制。目前研發出來的原位培養技術有：①擴散室(Diffusion Chamber)，無須對培養基成分探究，卻能提供環境微生物生長所需營養，非常方便。但仍存在一定的局限性，比如擴散室內進行原位培養時，細胞一般會形成肉眼不可見的小菌落，這些菌落就算延長培養時間也難以長大，因此在觀察計數方面要求較高，使得檢測和分離到純培養的工作變得費力繁瑣，很難做到高通量培養分離，特別是對于放線菌培養分離是很難做到的。另外，擴散室培養微生物的效果也取決于樣品的稀釋水平，對平板制作和膜材料選擇要求也較高，不能破壞微生物生長。②分離芯片(Isolation Chip)是基于以上問題設計的類似于擴散室的高通量分離裝置，這種設計使得大規模分離成為可能，但是也存在分離困難，操作復雜的缺陷，特別對于放線菌的培養分離是客觀上存在困難。③Trap技術，適合培養絲狀放線菌，可在實驗室中進行，操作簡單，缺點是不能對放線菌選擇性分離。

針對于現有國內外放線菌原位培養技術中存在著較多缺點，如：分離過程中采用熱處理、化學處理、添加抗生素等方法來去除環境中占優勢但非目標菌株；培養出的菌落較小，觀察計數要求較高；工作費力繁瑣等問題。因此急需一種針對放線菌操作簡單便捷、易于計數、保證絕大部分放線菌資源的原位培養方法。

發明內容