[發(fā)明專利]一種人肝癌組織和肝臟組織活性單細(xì)胞懸液的制備方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202010196718.8
• 申請日: 2020-03-19
• 公開（公告）號: CN111575236A
• 公開（公告）日: 2020-08-25
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王小輝;徐立;陳敏山;王駿成;施木德;張耀軍;鄒如海
• 申請（專利權(quán)）人: 中山大學(xué)腫瘤防治中心（中山大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院;中山大學(xué)腫瘤研究所）
• 主分類號: C12N5/09
• 分類號: C12N5/09;C12N5/071
• 代理公司: 廣州三環(huán)專利商標(biāo)代理有限公司 44202
• 代理人: 劉孟斌

本發(fā)明提供了一種人肝癌組織和肝臟組織活性單細(xì)胞懸液的制備方法，包括以下步驟：S1組織樣品保存以及轉(zhuǎn)運(yùn)：S2組織漂洗及預(yù)消化；S3組織消化；S4終止消化及過濾除雜；S5裂解紅細(xì)胞及第二次過濾；S6洗滌純化細(xì)胞：清除壞死細(xì)胞；S7重懸獲取細(xì)胞。由本發(fā)明肝臟組織活性單細(xì)胞懸液的制備方法獲得單細(xì)胞，其細(xì)胞活性較好，細(xì)胞總體活性大于70％，且操作較為簡單，穩(wěn)定性好。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種人肝癌組織和肝臟組織活性單細(xì)胞懸液的制備方法。

背景技術(shù)

近年來生物學(xué)的研究在單細(xì)胞領(lǐng)域取得飛躍的發(fā)展和進(jìn)步。如Cytof質(zhì)譜流式、BDRhapsody、10×Genomics等技術(shù)平臺應(yīng)運(yùn)而生。目前最為熱門的當(dāng)屬單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序的研究，它能夠在一定程度上詳細(xì)解析復(fù)雜樣本中不同類型細(xì)胞之間的特定差異，獲取到之前被全轉(zhuǎn)錄組測序所掩蓋的一些關(guān)鍵數(shù)據(jù)。此外，單細(xì)胞蛋白組的相關(guān)研究也在探索中，雖然目前只能對選定的蛋白組合進(jìn)行單細(xì)胞定量檢測，但單細(xì)胞蛋白定量同樣可以在單細(xì)胞水平得到不同細(xì)胞亞型之間的差異情況。然而不論是哪種研究，在進(jìn)行單細(xì)胞相關(guān)研究之前，獲得高質(zhì)量的單細(xì)胞懸液是實(shí)驗(yàn)成功的第一步，也是實(shí)驗(yàn)?zāi)軌蝽樌_展的關(guān)鍵一步。單細(xì)胞懸液制備不合格或失敗，后續(xù)研究便無從談起。

目前針對肝癌組織和正常肝組織單細(xì)胞懸液的制備中存在著較大的方法缺陷和技術(shù)難點(diǎn)，相關(guān)文獻(xiàn)資料及各生物技術(shù)公司對此制備方法雖有描述和介紹，但均難以在實(shí)驗(yàn)中保持穩(wěn)定及可重復(fù)性，且各方介紹的制備方法存在消化時(shí)間過長及細(xì)胞活性明顯不足等關(guān)鍵技術(shù)缺陷。因此，本課題組經(jīng)反復(fù)實(shí)驗(yàn)探索及充分驗(yàn)證后建立了一項(xiàng)高效制備人肝癌組織和人肝臟組織單細(xì)胞懸液的關(guān)鍵技術(shù)。該項(xiàng)技術(shù)屬于生物實(shí)驗(yàn)制備技術(shù)，主要用于肝臟疾病及肝癌的單細(xì)胞相關(guān)研究，解決目前對肝臟組織及肝癌組織進(jìn)行單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序時(shí)單細(xì)胞懸液制備成功率較低的關(guān)鍵問題。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于克服上述現(xiàn)有技術(shù)的不足之處而提供一種人肝癌組織和肝臟組織活性單細(xì)胞懸液的制備方法。經(jīng)本發(fā)明的探索及充分驗(yàn)證后研究出一項(xiàng)高效制備肝臟單細(xì)胞懸液的制備方法。該方法主要用于解決對肝臟組織及肝癌組織進(jìn)行單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序時(shí)單細(xì)胞懸液制備成功率較低的問題。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案為：一種人肝癌組織和肝臟組織活性單細(xì)胞懸液的制備方法，包括以下步驟：

S1組織樣品保存以及轉(zhuǎn)運(yùn)：將穿刺組織標(biāo)本離體后快速浸泡入裝有預(yù)冷培養(yǎng)基的采樣容器中，轉(zhuǎn)運(yùn)時(shí)間不超過20分鐘；

S2組織漂洗及預(yù)消化：將獲取的肝組織用無血清培養(yǎng)基漂洗，漂洗后將組織進(jìn)行預(yù)消化；

S3組織消化：將剪碎的肝組織浸泡于培養(yǎng)基中，加入組織消化酶，放入搖床進(jìn)行震蕩消化；

S4終止消化及過濾除雜：在步驟S2的消化液中加入血清和無血清培養(yǎng)基，搖勻，然后過濾消化液，離心除雜，收集沉淀；

S5裂解紅細(xì)胞及第二次過濾：在步驟S3中的沉淀中加入紅細(xì)胞裂解液搖勻靜置，將其經(jīng)過濾器進(jìn)行過濾，離心；

S6洗滌純化細(xì)胞：清除壞死細(xì)胞；

S7重懸獲取細(xì)胞：在細(xì)胞沉淀中加入預(yù)冷PBS重懸細(xì)胞。

優(yōu)選地，在將組織標(biāo)本浸泡于采樣容器之前，還包括以下步驟：準(zhǔn)備裝有冰塊的冰盒，向采樣容器中加入預(yù)冷的無血清培養(yǎng)基。本發(fā)明實(shí)施例中采用的冰盒為長寬高分別約40cm×30cm×40cm塑料冰盒；在15ml塑料采樣杯(或15ml離心管)中加入5-8ml預(yù)先存放4℃冰箱預(yù)冷的無血清培養(yǎng)基DMEM或1640。

優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基為無血清培養(yǎng)基DMEM或1640。

優(yōu)選地，所述肝組織包括肝癌組織和正常肝組織。

優(yōu)選地，所述肝組織包括穿刺組織和手術(shù)標(biāo)本組織。