[發明專利]一種人肝癌組織和肝臟組織活性單細胞懸液的制備方法

在審

• 申請號: 202010196718.8
• 申請日: 2020-03-19
• 公開（公告）號: CN111575236A
• 公開（公告）日: 2020-08-25
• 發明（設計）人: 王小輝;徐立;陳敏山;王駿成;施木德;張耀軍;鄒如海
• 申請（專利權）人: 中山大學腫瘤防治中心（中山大學附屬腫瘤醫院;中山大學腫瘤研究所）
• 主分類號: C12N5/09
• 分類號: C12N5/09;C12N5/071
• 代理公司: 廣州三環專利商標代理有限公司 44202
• 代理人: 劉孟斌

1.一種人肝癌組織和肝臟組織活性單細胞懸液的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：

S1組織樣品保存以及轉運：將穿刺組織標本離體后快速浸泡入裝有預冷培養基的采樣容器中，轉運時間不超過20分鐘；

S2組織漂洗及預消化：將獲取的肝組織用無血清培養基漂洗，漂洗后將組織進行預消化；

S3組織消化：將剪碎的肝組織浸泡于培養基中，加入組織消化酶，放入搖床進行震蕩消化；

S4終止消化及過濾除雜：在步驟S2的消化液中加入血清和無血清培養基，搖勻，然后過濾消化液，離心除雜，收集沉淀；

S5裂解紅細胞及第二次過濾：在步驟S3中的沉淀中加入紅細胞裂解液搖勻靜置，將其經過濾器進行過濾，離心；

S6洗滌純化細胞：清除壞死細胞；

S7重懸獲取細胞：在細胞沉淀中加入預冷PBS重懸細胞。

2.如權利要求1所述的制備方法，其特征在于，在將組織標本浸泡于采樣容器之前，還包括以下步驟：準備裝有冰塊的冰盒，向采樣容器中加入預冷的無血清培養基。

3.如權利要求2所述的制備方法，其特征在于，所述培養基為無血清培養基為DMEM或1640。

4.如權利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述肝組織包括肝癌組織和正常肝組織。

5.如權利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述肝組織包括穿刺組織和手術標本組織。

6.如權利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述穿刺組織為16G或18G穿刺針留取3條或3條以上穿刺組織。

7.如權利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述手術標本組織為切取鮮活組織200-500mg。

8.如權利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述步驟S1中預消化的具體步驟為：漂洗完后將組織浸泡在加入消化酶的培養基孔板中預消化5分鐘，間斷60秒輕輕搖晃15秒。

9.如權利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述步驟S2中消化的具體步驟為：培養基完全浸泡的組織剪碎的肝組織，再加入消化酶，搖勻1分鐘，置于37℃搖床，傾斜45度角放置，搖速180RPM，搖床震蕩15分鐘。

10.如權利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述步驟S4中過濾前用紅細胞裂解液預先濕潤過濾器，離心條件為：4℃，450g(約1600rpm)，5分鐘，加速度5降速度4。