[發明專利]基于重組減毒李斯特菌的KRAS高表達癌癥疫苗及其制備方法及其應用方法

在審

• 申請號: 202010196375.5
• 申請日: 2020-03-19
• 公開（公告）號: CN111388658A
• 公開（公告）日: 2020-07-10
• 發明（設計）人: 沈海淺;王子豪;沈浩
• 申請（專利權）人: 嘉晨西海（杭州）生物技術有限公司
• 主分類號: A61K39/00
• 分類號: A61K39/00;A61P35/00;C12N1/21;C12N15/12;C12N15/74;C12R1/01
• 代理公司: 杭州裕陽聯合專利代理有限公司 33289
• 代理人: 金方瑋

1.基于重組減毒李斯特菌的KRAS高表達癌癥疫苗，其特征在于，為LmΔactA/plcB-KRAS菌株的菌液；所述LmΔactA/plcB-KRAS菌株是以減毒單增李斯特菌為載體，攜帶KRAS蛋白基因的基因重組菌；

所述減毒單增李斯特菌為單增李斯特菌完整敲除actA和plcB這兩個毒力基因而得；

所述KRAS蛋白基因由KRAS蛋白氨基酸序列經過李斯特菌密碼子優化后，在上游加入HindⅢ酶切位點，下游加入Xho Ⅰ酶切位點，通過合成獲得的DNA序列，SEQ ID NO.1。

2.基于重組減毒李斯特菌的KRAS高表達癌癥疫苗，其特征在于，為LiΔactA/plcB-KRAS菌株的菌液；所述LiΔactA/plcB-KRAS菌株是以減毒綿羊李斯特菌為載體，攜帶KRAS蛋白基因的基因重組菌；

所述減毒綿羊李斯特菌為綿羊李斯特菌完整敲除actA和plcB這兩個毒力基因而得；

所述KRAS蛋白基因由KRAS蛋白氨基酸序列經過李斯特菌密碼子優化后，在上游加入HindⅢ酶切位點，下游加入Xho Ⅰ酶切位點，通過合成獲得的DNA序列，SEQ ID NO.1。

3.基于重組減毒李斯特菌的KRAS高表達癌癥疫苗的制備方法，其特征在于，制備重組減毒單增李斯特菌的步驟包括：

步驟一，合成KRAS基因片段；

查詢KRAS(G12D，G12V突變)氨基酸序列，然后根據李斯特菌偏好密碼子表進行密碼子優化得到優化后的序列，再在其上游加入HindⅢ酶切位點(AAGCTT)，下游加入Xho Ⅰ酶切位點(CTCGAG)，將設計好的序列通過合成直接獲得；

步驟二，構建打靶質粒；

用限制性內切酶HindⅢ和Xho Ⅰ雙酶切步驟一獲得的KRAS基因片段，同時用相同的限制性內切酶酶切質粒pCW203(專利CN103074361B)，經連接、轉化等技術將KRAS基因片段插入pCW203 HindⅢ和Xho Ⅰ酶切位點，得到中間質粒pCW203-KRAS，如SEQ ID NO.2所示，通過PCR驗證、提質粒驗證、酶切驗證證實中間質粒的成功構建。切下步驟中間質粒pCW203-KRAS的BamHI酶切位點與XhoI酶切位點之間的片段插入重組質粒pCW180的BamHI酶切位點與XhoI酶切位點之間，得到打靶質粒pCW180-KRAS；其中，所述重組質粒pCW180的基因序列為序列表中SEQ ID NO.3所示；

步驟三，制備感受態細胞LmΔactAplcB-lacZ；

培養LmΔactAplcB-lacZ，定期測定A₆₀₀，當A₆₀₀＝0.4時，加入盤尼西林G，使其終濃度為12.5μg/ml繼續培養；當A₆₀₀＝0.7時，離心，洗滌，分裝，保存，得到LmΔactA/plcB-lacZ感受態細胞；

步驟四，利用打靶質粒對感受態細胞LmΔactAplcB-lacZ進行電轉化；

取打靶質粒電轉至LmΔactA/plcB-lacZ感受態細胞中，用電轉儀電轉后用培養液培養；將轉化液涂布于紅霉素BHI瓊脂平板，通過藍白斑篩選出單個藍色菌落，純培養后進行質粒提取和PCR驗證；

步驟五，將LmΔactAplcB-lacZ與打靶質粒同源重組雜交培養、篩選驗證；

將攜帶打靶質粒的單增李斯特菌，在42℃和30℃連續傳代培養，利用同源重組雜交原理和基因打靶技術，將打靶質粒攜帶的目的片段整合至李斯特菌中，利用藍白斑及紅霉素敏感性篩選出可疑菌株；然后進行PCR篩選和基因測序驗證；選出LmΔactA/plcB-KRAS菌株，制備菌液，得到疫苗。