[發明專利]一種用于對肉果秤錘樹進行分子鑒定的rpl32-trnL分子標記及其應用

有效

• 申請號: 202010190083.0
• 申請日: 2020-03-18
• 公開（公告）號: CN111172318B
• 公開（公告）日: 2021-08-17
• 發明（設計）人: 范晶;羅樹華;孫麗娟
• 申請（專利權）人: 樂山師范學院
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12N15/11
• 代理公司: 成都正華專利代理事務所(普通合伙) 51229
• 代理人: 郭艷艷

本發明公開了一種用于瀕危肉果秤錘樹分子鑒定的rpl32?trnL分子標記及其應用。該分子標記為如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。本發明提供了一種用于對肉果秤錘樹進行分子鑒定的rpl32?trnL分子標記。該分子標記是在肉果秤錘樹葉綠體全基因組序列測序和組裝的基礎上，通過比較秤錘樹屬植物葉綠體全基因組序列，分析篩選高變區域，然后以含有高變區的DNA片段作為設計引物的DNA模板，通過引物設計軟件自主設計PCR引物，PCR擴增驗證開發的分子標記。該分子標記可在物種水平上對肉果秤錘樹進行鑒定，為今后種質資源的保護和生物多樣性的檢測提供重要信息。

技術領域

本發明屬于分子生物學技術領域，具體涉及一種用于對肉果秤錘樹進行分子鑒定的rpl32-trnL分子標記及其應用。

背景技術

秤錘樹屬(Sinojackia)是中國特有的落葉喬木或灌木，系統位置處于安息香科(Styracaceae)內孤立的寡種屬，該類植物其形態特殊，在安息香科的系統發育研究中卓有價值。近年來，隨著人類對自然資源開發利用的加快，秤錘樹屬植物的棲息地和生長環境受到影響甚至破壞，造成種質資源的急劇喪失。其中，棱果秤錘樹在野外已處于滅絕狀態。肉果秤錘樹(Sinojackia sarcocarpa LQ Luo)開白色小花，植株外形美觀，具有較好的觀賞價值。此外，它還含有用于治療關節炎、血栓閉塞性脈管炎和心絞痛等疾病的有效成分，可作為藥用兼觀賞的園林樹種。然而，該物種目前也瀕臨滅絕，其模式種群棲息地僅局限于面積不足 200m²的區域，數量僅有十余株。物種的滅絕將導致基因喪失及生物多樣性減少。當前，物種多樣性保護已經成為公眾關注的熱點問題，開展肉果秤錘樹的遺傳保護工作迫在眉睫。

識別和評估瀕危物種是維持生物多樣性以及制定保護策略的重要前提。傳統基于形態標準的物種鑒定往往需要專業知識，只有少數長期從事分類學的人員才能有效掌握。常規情況下，肉果秤錘樹的分類和鑒定依據形態學、尤其是果實形態學。但是，肉果秤錘樹的果實外形與秤錘樹等相似，不同植株的果實形態會存在變異。因此，僅僅依靠果實形態來識別肉果秤錘樹可導致分類錯誤，不利于肉果秤錘樹種質資源的評價。

分子標記可廣泛應用于植物分子鑒定及系統分析，在很大程度上彌補了形態分類結果的不足，成為植物系統分類學研究的有力工具。目前，核糖體ITS 基因和葉綠體基因(trnH-psbA、trnS-trnG、atpB–rbcL、rps4和trnL)已被用于秤錘樹屬植物的分子鑒定。植物葉綠體基因組結構保守、很少重組和突變且多數情況下是單親遺傳，在植物系統進化和物種鑒定研究中具有重要的實用價值。隨著葉綠體基因組測序成本的降低及研究技術的成熟，越來越多的葉綠體基因組序列被揭示，基于這些序列的新型分子標記的進一步開發潛力將被充分認識和利用。

發明內容

為進一步豐富肉果秤錘樹葉綠體來源的分子遺傳標記，本發明提供一種用于肉果秤錘樹分子鑒定的rpl32-trnL分子標記及其在肉果秤錘樹物種鑒定等方面的應用。

本發明開發了一個能夠在物種水平上對肉果秤錘樹進行分子鑒定的 rpl32-trnL分子標記，該DNA片段的可變區位于rpl32和trnL兩個基因序列之間。同時，還自行設計擴增rpl32-trnL分子標記相應靶序列的引物并測試其適用性。

為實現上述目的，本發明解決其技術問題所采用的技術方案是：

一種肉果秤錘樹葉綠體全基因組分子標記開發方法，其特征是利用Mafft v7.037軟件比較肉果秤錘樹及其近緣種葉綠體全基因組序列，分析序列的插入、缺失和堿基替換等微結構差異式樣，確定葉綠體基因組序列的可變區。使用 Mega-X v10.0.5軟件計算可變區內葉綠體分子標記的總差異位點，選擇差異位點較多、且含肉果秤錘樹特異序列的高度差異區域作為DNA模板，設計PCR 擴增引物。

一種用于肉果秤錘樹分子鑒定的rpl32-trnL分子標記，該rpl32-trnL分子標記為如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。