[發明專利]構建包含大片段反向互補序列載體的方法在審
| 申請號： | 202010187451.6 | 申請日： | 2020-03-17 |
| 公開（公告）號： | CN111349638A | 公開（公告）日： | 2020-06-30 |
| 發明（設計）人： | 劉云;楊玲玲 | 申請（專利權）人： | 深圳市澤龍生物技術有限公司 |
| 主分類號： | C12N15/66 | 分類號： | C12N15/66 |
| 代理公司： | 深圳壹舟知識產權代理事務所(普通合伙) 44331 | 代理人： | 寇闖 |
| 地址： | 518000 廣東省深圳市龍華區龍華*** | 國省代碼： | 廣東;44 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 構建 包含 片段 反向 互補 序列 載體 方法 | ||
1.一種構建包含大片段反向互補序列的方法，其中反向互補序列跨度大于或等于100bp，反向互補序列同源性大于或等于50％，該方法包括以下步驟：
S1：序列分割：把目標序列分成兩個無反向互補序列的片段：片段1，片段2，在每個片段的兩端均設計為包含Type IIS酶切位點，合成這兩個片段；
S2：酶切/連接反應：將片段1和片段2和/或克隆載體用type IIS內切酶進行酶切，然后用連接酶進行連接，得到連接產物。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，酶切和連接反應在同一反應體系中進行。
3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟S2中還包括加熱使酶失活的步驟。
4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟S1中分解成兩個無反向互補序列的片段中，分解位點位于兩個反向互補序列之間任何兩個相鄰堿基位點之間。
5.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述酶切反應溫度為25℃-58℃，連接反應溫度為4℃-24℃。
6.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，還包括：
S3：轉化：將步驟S2獲得的包括克隆載體的連接產物轉化至感受態細胞，將感受細胞在平板培養基中進行抗生素篩選。
7.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟S1中Type IIS酶是BsaI、BmsBI、BbsI或SpaI。
8.根據權利要求1至7中任一項所述的方法，其特征在于，步驟S2中連接酶為T4連接酶。
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