[發(fā)明專(zhuān)利]一種利用鉤藤不定芽誘導(dǎo)四倍體植株的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202010176997.1
• 申請(qǐng)日: 2020-03-13
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN111165358B
• 公開(kāi)（公告）日: 2023-05-02
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 冷燕
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 臨滄惠康中藥材資源開(kāi)發(fā)有限公司
• 主分類(lèi)號(hào): A01H4/00
• 分類(lèi)號(hào): A01H4/00
• 代理公司: 昆明祥和知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 53114
• 代理人: 和琳

本發(fā)明涉及一種中藥材的多倍體培養(yǎng)方法，具體為一種利用鉤藤不定芽誘導(dǎo)四倍體植株的方法，依次通過(guò)不定芽的無(wú)菌培養(yǎng)、多倍體誘導(dǎo)、嵌合體分離培養(yǎng)、四倍體篩選、四倍體擴(kuò)增以及四倍體生根步驟實(shí)現(xiàn)，本發(fā)明采用了獨(dú)特的多倍體誘導(dǎo)液、嵌合體分離培養(yǎng)培養(yǎng)基、增殖培養(yǎng)基及生根培養(yǎng)基，本方法的鉤藤四倍體誘導(dǎo)率為18%，經(jīng)90~180天即可獲得大量四倍體鉤藤種苗，種苗在形態(tài)上根、莖、葉均明顯增粗增厚，經(jīng)栽植后植株明顯矮化，植株的抗旱抗逆能力顯著提升，藥材畝產(chǎn)量提高50~100%，鉤藤總堿含量較原母種提高0.12%。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種中藥材的多倍體培養(yǎng)方法，屬于植物作物育種及中藥材種植領(lǐng)域，特別涉及鉤藤的多倍體培養(yǎng)方法。

背景技術(shù)

鉤藤（ Uncaria?rhynchophylla（Miq.）Miq.?ex?Havil.）為茜草科鉤藤屬屬多年生木質(zhì)藤本植物，以帶鉤莖枝入藥，有熄風(fēng)定驚，清熱平肝的功效，主要用于肝風(fēng)內(nèi)動(dòng)，驚癇抽搐，高熱驚厥，小兒驚啼，妊娠子癇，頭疼眩暈等癥?，F(xiàn)代醫(yī)藥研究其內(nèi)含鉤藤堿，有降血壓、抗血小板凝聚和抗血栓的功效，用于治療部分心腦血管疾病。目前以鉤藤為原料藥的中藥制劑約170余種，藥材年需求量大。野生主要分布于云南、廣東、廣西、貴州、福建、湖南、湖北、江西等地，云南產(chǎn)地生于海拔1300~1900m的山谷溪邊的疏林或灌木叢中。目前貴州、廣西已形成一定規(guī)模種植。近年來(lái)，隨著其開(kāi)發(fā)用途的增加以及療效的臨床認(rèn)可度提高，需求量逐年上升，鉤藤藥材價(jià)格亦隨之上升，目前的種植規(guī)模產(chǎn)能已不能滿足市場(chǎng)需求。傳統(tǒng)的繁殖方式主要有種子繁殖和扦插繁殖，種子繁殖存在繁殖周期長(zhǎng)、種質(zhì)性狀不穩(wěn)定等缺點(diǎn)，而扦插繁殖具有繁殖率低，種苗及種植過(guò)程中病蟲(chóng)害嚴(yán)重等缺點(diǎn)。同時(shí)，鉤藤在各企業(yè)藥材標(biāo)準(zhǔn)中大部分有鉤藤堿含量檢測(cè)指標(biāo)，由于鉤藤品種較多，即使同種不同品種間差異亦較大，使得藥材質(zhì)量參差不齊。

多倍體是普遍存在于自然界中，是生物自身體細(xì)胞中具有三個(gè)或三個(gè)以上的染色體，常見(jiàn)于高等植物中，許多植物在進(jìn)化的過(guò)程都經(jīng)歷了“多倍體化”與“二倍體化”。由于多倍體具有營(yíng)養(yǎng)器官巨大性、抗逆性增強(qiáng)、生長(zhǎng)率提高、有效成分含量增加等特點(diǎn)，因此，多倍體是作物育種的重要方式，亦是藥用植物育種的重要方向，目前許多重要的糧食作物和經(jīng)濟(jì)作物都是多倍體。自然界中雖然多倍體廣泛存在，但數(shù)量有限，而通過(guò)人工誘導(dǎo)，可以在短期內(nèi)大量擴(kuò)增。目前人工誘導(dǎo)多倍體的方式主要有化學(xué)誘導(dǎo)、物理誘導(dǎo)，其中以化學(xué)誘導(dǎo)因其操作簡(jiǎn)便、專(zhuān)一性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，是最為有效且應(yīng)用最為廣泛的方法。

一方面鉤藤中所含有效成分鉤藤堿是鉤藤內(nèi)含成分應(yīng)用最為廣泛的物質(zhì)，其含量也是國(guó)家以及企業(yè)檢測(cè)鉤藤藥材是否達(dá)標(biāo)的最重要指標(biāo)，同時(shí)，鉤藤堿含量越高，其藥材價(jià)格以及價(jià)值也越大。另一方面，鉤藤一般以鉤為單位采收，而按目前鉤藤的種植參數(shù)，鉤藤畝產(chǎn)鉤量?jī)H為40~80千克，產(chǎn)量較低，制約了鉤藤產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明針對(duì)上述現(xiàn)有鉤藤種植產(chǎn)業(yè)的不足，利用現(xiàn)代作物育種及生物技術(shù)，對(duì)鉤藤進(jìn)行染色體加倍，獲得鉤藤四倍體，增加了鉤藤單位面積產(chǎn)量以及藥用價(jià)值。

本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：

1、無(wú)菌不定芽的培養(yǎng)：

（1）選取健壯、無(wú)病蟲(chóng)害鉤藤幼嫩芽，用飽和肥皂水溶液涮洗10~15min，后用自來(lái)水沖洗3-4次至無(wú)肥皂液殘留，加適量水，再加2~3滴吐溫-80，振搖10~15min，用自來(lái)水沖淋50~60min；

（2）轉(zhuǎn)移至超凈工作臺(tái)內(nèi)，加入75%酒精振搖15~20s，無(wú)菌水涮洗3~4次，再加入0.1%升汞溶液振搖5~7min，無(wú)菌水涮洗6~8次，用無(wú)菌紙吸去外植體表面水分；

（3）將消毒完成幼嫩芽，接種于1/2MS+NAA?0.1~0.5mg/L+BA3.0~5.0mg/L的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，在溫度23~27℃，光照強(qiáng)度1000~2000lux，單日光照時(shí)間10h的環(huán)境下培養(yǎng)20~30天。

2、不定芽的多倍體誘導(dǎo)：