[發(fā)明專利]解吸附鋁鹽吸附型疫苗中的抗原的解吸附劑及抗原含量檢測方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202010172908.6
• 申請日: 2020-03-13
• 公開（公告）號: CN111308071B
• 公開（公告）日: 2021-06-18
• 發(fā)明（設計）人: 李玉華;李景良;王穎;陳娜娜;王玲;劉晶晶;劉巖松;孫宏亮;楊紅育;李帥;邱野;姜崴
• 申請（專利權）人: 長春生物制品研究所有限責任公司
• 主分類號: G01N33/569
• 分類號: G01N33/569;G01N27/447
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發(fā)明公開了解吸附鋁鹽吸附型疫苗中的抗原的解吸附劑及抗原含量檢測方法。所述解吸附劑為檸檬酸鈉溶液，并包含一種穩(wěn)定蛋白構象并增加檢測特異性的非離子型表面活性劑。本發(fā)明的解吸附鋁鹽吸附型疫苗中的抗原的解吸附劑不但能夠很好的解吸附，同時病毒抗原結構不受影響或者幾乎不受影響，完整保持了其免疫原性。

技術領域

本發(fā)明屬于生物技術領域。具體而言，本發(fā)明涉及森林腦炎和出血熱滅活疫苗中氫氧化鋁佐劑的解吸附劑及其抗原含量檢測方法。

背景技術

森林腦炎病毒抗原、腎綜合征出血熱病毒抗原是森林腦炎和腎綜合征出血熱疫苗中的主要有效成分，其有效含量與疫苗接種后的保護效果直接相關，因此，其抗原含量是森林腦炎、腎綜合征出血熱滅活疫苗質量控制中的一項重要檢測指標。

森林腦炎病毒呈球形，直徑為30～40nm，衣殼二十面體對稱外有包膜，含血凝素糖蛋白E，是病毒的重要抗原成分，包含有中和抗原表位和型特異性抗原表位，決定了病毒的細胞嗜性和毒力，與病毒的吸附、穿入、致病等作用密切相關，并且具有血凝活性，能刺激機體產(chǎn)生中和抗體和血凝抑制抗體，其結構的完整性代表了疫苗的有效性。

腎綜合征出血熱病毒屬于漢坦病毒屬，單負鏈RNA，基因組分為L、M、S三個片段，分別編碼病毒的RNA聚合酶(L)、包膜糖蛋白(Gn和Gc)和核衣殼蛋白(NP)。腎綜合征出血熱病毒顆粒表面有脂質雙層包膜，包膜表面有Gn和Gc糖蛋白構成的突起。Gn和Gc糖蛋白上均有中和抗原位點和血凝活性位點，能夠刺激機體產(chǎn)生特異性抗體，是主要的抗原決定簇。其結構的完整性代表了疫苗的有效性。

帶有包膜病毒顆粒不穩(wěn)定，易受到外界環(huán)境條件的影響，比如溫度、紫外線、有機溶劑等，從而使病毒顆粒包膜受到破壞，導致免疫原性下降，無法通過酶聯(lián)免疫(ELSIA)進行抗原定量。

目前國內臨床接種應用的帶有氫氧化鋁佐劑的包膜病毒抗原疫苗主要為森林腦炎和雙價腎綜合征出血熱疫苗。森林腦炎、腎綜合征出血熱疫苗中的抗原為滅活病毒，為使接種者更有效的獲得免疫，需要加入氫氧化鋁佐劑制備成吸附型疫苗，誘導機體對病毒抗原產(chǎn)生更強的免疫反應。氫氧化鋁佐劑與抗原表面攜帶的電荷基團發(fā)生共價或配位結合，以顆粒的方式包裹抗原，與抗原一起形成可溶性大顆粒，增加病毒結構復雜性，從而使復合物更具免疫原性。氫氧化鋁佐劑與病毒的結合屏蔽了抗原表面的特異性結合位點，進而在抗原的ELSIA檢測過程中，無法與酶聯(lián)反應板或酶標抗體上的特異性抗體相結合，從而導致抗原無法檢出。針對這一類吸附疫苗還沒有成熟的抗原含量檢測方法，特別是對吸附森林腦炎、腎綜合征出血熱疫苗的病毒抗原檢測，也未見文獻報道。

為了能夠準確測定吸附疫苗中的病毒抗原，需要首先解離抗原與鋁鹽佐劑之間的相互作用力，使抗原先從佐劑上解離下來，重新暴露出抗原表面上相應的抗原決定簇，再采用酶聯(lián)免疫吸附法對其進行檢測。據(jù)文獻報道，部分金屬離子螯合劑、表面活性劑、有機酸、無機堿等物質可以針對性破壞抗原與佐劑之間的相互作用力，達到解離抗原的目的。其中主要有十六烷基磺酸鈉，Triton-100，鹽酸胍、碳酸氫鈉和磷酸根離子等作為鋁鹽佐劑解吸附劑，其作用機理可能是通過解離液與鋁佐劑相互作用，破壞與抗原之間的相互作用力，從而使病毒抗原解離下來。但是，幾乎所有解吸附劑都會或多或少的對蛋白質的結構造成破壞，引起蛋白質變性，特別對包膜病毒，極易受到化學試劑、pH和溫度的影響，導致其結構被破壞，從而無法進行檢測。研究表明，使用7.5％的碳酸氫鈉溶液或濃度為1-5％的十二烷基磺酸鈉溶液對鋁佐劑吸附森林腦炎、腎綜合征出血熱滅活疫苗處理2小時，對其病毒抗原表面的特異性蛋白結構造成損害，導致抗原無法檢出。羅翀等(一種處理液以及采用其測定鋁鹽吸附型疫苗中抗原含量的方法)采用磷酸鹽緩沖液或檸檬酸鹽緩沖液，并包含蛋白質以及一種或多種酸和/或它們的鹽作為解吸附劑對乙型腦炎疫苗中的氫氧化鋁佐劑進行處理，成功檢測了乙腦病毒抗原。

發(fā)明內容