[發明專利]超高效液相色譜串聯質譜技術檢測血清中9種水溶性維生素的方法

在審

• 申請號: 202010172708.0
• 申請日: 2020-03-12
• 公開（公告）號: CN111398451A
• 公開（公告）日: 2020-07-10
• 發明（設計）人: 成曉亮;李美娟
• 申請（專利權）人: 南京品生醫學檢驗實驗室有限公司
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02;G01N30/06;G01N30/14
• 代理公司: 南京思拓知識產權代理事務所(普通合伙) 32288
• 代理人: 呂鵬濤

1.一種超高效液相色譜串聯質譜技術檢測血清中9種水溶性維生素的方法，

所述9種水溶性維生素分別為：維生素B1、維生素B2、維生素B3、維生素B5、維生素B6、維生素B7、維生素B12、5-甲基四氫葉酸和維生素C；

上述9種水溶性維生素對應的同位素內標物分別為：維生素B1-13C4、維生素B2-13C4,15N2、維生素B3-13C3,15N、維生素B5-13C3,15N、維生素B6-d3、維生素B7-d4、維生素B12-15N6、5-甲基四氫葉酸-13C,d3和維生素C-13C6；

采用超高效液相色譜串聯質譜技術檢測經過預處理的血清中的水溶性維生素，先利用超高效液相色譜將目標待測物與血清基質中的干擾組分進行分離，再利用質譜檢測目標物與其對應同位素內標的質荷比，使用同位素內標法定量，分別計算出9種水溶性維生素的含量，具體色譜條件為：

(1)超高效液相色譜條件：

流動相A：0.01～0.5％甲酸-1～10mM甲酸銨水溶液；流動相B：甲醇；

色譜柱型號：Agilent Pursuit PFP 2.0×150mm，3.0μm；

采用流動相A和流動相B為混合流動相進行梯度洗脫，所述梯度洗脫過程如下：在0-1.0分鐘內，流動相A和流動相B的體積比由98:2勻速漸變至50:50；在1.0-2.5分鐘內，流動相A和流動相B的體積比由50:50勻速漸變至2:98；在2.5-3.0分鐘內，流動相A和流動相B的體積比為2:98；在3.0-5.0分鐘內，流動相A和流動相B的體積比由2:98勻速漸變至98:2；

(2)質譜條件：

在電噴霧電離(ESI)模式下，采用多反應監測(MRM)進行正負切換掃描；噴霧電壓為0.5kV(ESI+)；離子源溫度為120℃；霧化氣溫度為400℃，霧化氣流速為800L/h，錐孔氣流速為150L/h；同時監測了9種水溶性維生素及其對應同位素內標。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，

所述流動相A為0.1～0.5％甲酸-1～5mM甲酸銨水溶液；流速為0.2～0.5mL/min；柱溫為35～45℃；進樣體積為1～10μL。

3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，

所述流動相A為0.1％甲酸-2mM甲酸銨水溶液；所述流速為0.3mL/min；所述柱溫為40℃；所述進樣體積為5μL。

4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述血清為人或動物血清。

5.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述色譜柱為五氟苯基柱。

6.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，

所述經過預處理的血清按照如下方法制備：向血清加入混合內標工作液，渦旋后加入蛋白沉淀劑，再渦旋離心后取上清液；所述蛋白質沉淀劑為甲醇。

7.根據權利要求6所述的方法，其特征在于，

所述經過預處理的血清按照如下方法制備：取50μL血清于1.5mL離心管中，向其中加入20μL混合內標工作，渦旋后加入180μL甲醇，在12000～15000r/min，10～20℃離心4～10min后，取70μL上清液。