[發(fā)明專利]用于檢測(cè)犬細(xì)小病毒的引物組及其應(yīng)用

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202010171858.X
• 申請(qǐng)日: 2020-03-12
• 公開（公告）號(hào): CN111394512A
• 公開（公告）日: 2020-07-10
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 賈紅;王召陽;劉雪婷;鑫婷;姜一曈;朱鴻飛
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所
• 主分類號(hào): C12Q1/70
• 分類號(hào): C12Q1/70;C12Q1/6844;C12N15/11;C12R1/93
• 代理公司: 北京知呱呱知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11577
• 代理人: 杜立軍

本發(fā)明實(shí)施例公開了一種用于檢測(cè)犬細(xì)小病毒的引物組，所述引物組包括外引物對(duì)、內(nèi)引物對(duì)以及環(huán)形引物對(duì)，其中，所述外引物對(duì)中一條引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，另一條引物的核苷酸序序列如SEQ ID NO：2所示；所述內(nèi)引物對(duì)中一條引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，另一條引物的核苷酸序序列如SEQ ID NO：4所示；所述環(huán)形引物對(duì)中一條引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示，另一條引物的核苷酸序序列如SEQ ID NO：6所示。本發(fā)明實(shí)施例根據(jù)犬細(xì)小病毒基因組中的VP2基因序列特征，設(shè)計(jì)特異性的實(shí)時(shí)熒光環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增引物組，實(shí)用性強(qiáng)，可憑借實(shí)時(shí)熒光信號(hào)及溶解曲線直接判定結(jié)果，特異性強(qiáng)，靈敏度高。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明實(shí)施例涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種用于檢測(cè)犬細(xì)小病毒的引物組及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

犬細(xì)小病毒(Canine parvovirus，犬細(xì)小病毒)是Eugster于1977年通過電鏡觀察腹瀉犬只糞便發(fā)現(xiàn)的新型病毒，1979年由M.J.Appel等首先從患腸炎的病犬中分離獲得，自發(fā)現(xiàn)以來一直在世界范圍內(nèi)傳播。犬細(xì)小病毒可引起犬患上以劇烈嘔吐、出血性腸炎、嚴(yán)重脫水、白細(xì)胞減少和心肌炎等為特征的急性接觸性傳染病。犬細(xì)小病毒病是危害犬群生命安全的最主要流行病之一，發(fā)病率高，死亡率高，尤其易致幼犬患病甚至死亡，給當(dāng)前養(yǎng)犬業(yè)帶來巨大的危害。犬細(xì)小病毒是細(xì)小病毒科、細(xì)小病毒屬的單股負(fù)鏈線狀DNA病毒。犬細(xì)小病毒基因組含有兩個(gè)開放閱讀框(ORF)，分別編碼非結(jié)構(gòu)蛋白NS1、NS2和結(jié)構(gòu)蛋白VP1、VP2。該病毒自1978年發(fā)現(xiàn)以來，基因和抗原不斷發(fā)生變異，1979年，原始犬細(xì)小病毒-2型毒株進(jìn)化為2a亞型(犬細(xì)小病毒-2a)，1984年又發(fā)現(xiàn)了變異株犬細(xì)小病毒-2b。2001年，在意大利發(fā)現(xiàn)新的變異株犬細(xì)小病毒-2c[5]。隨著犬細(xì)小病毒-2對(duì)宿主的適應(yīng)和變異，新抗原變異型犬細(xì)小病毒-2a、犬細(xì)小病毒-2b和犬細(xì)小病毒-2c逐步替代了犬細(xì)小病毒-2的流行。犬細(xì)小病毒-2抗原變異的同時(shí)，其對(duì)宿主(犬、貓)嗜性、毒力等生物學(xué)特性也隨之改變。犬細(xì)小病毒感染的實(shí)驗(yàn)室診斷方法主要有病毒分離鑒定、血凝試驗(yàn)(HA)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)、聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)，這些方法存在操作繁瑣、技術(shù)和試驗(yàn)條件要求高、試驗(yàn)周期長(zhǎng)等缺點(diǎn)，難以滿足臨床上快速、大量檢測(cè)的需要。

發(fā)明內(nèi)容

為此，本發(fā)明實(shí)施例提供一種用于檢測(cè)犬細(xì)小病毒的引物組及其應(yīng)用，以解決現(xiàn)有技術(shù)中檢測(cè)犬細(xì)小病毒特異性、敏感性差的問題。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明實(shí)施例提供如下技術(shù)方案：

一種用于檢測(cè)犬細(xì)小病毒的引物組，所述引物組包括外引物對(duì)、內(nèi)引物對(duì)以及環(huán)形引物對(duì)，其中，

所述外引物對(duì)中一條引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，另一條引物的核苷酸序序列如SEQ ID NO：2所示；

所述內(nèi)引物對(duì)中一條引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，另一條引物的核苷酸序序列如SEQ ID NO：4所示；

所述環(huán)形引物對(duì)中一條引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示，另一條引物的核苷酸序序列如SEQ ID NO：6所示。

本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述引物組是針對(duì)犬細(xì)小病毒VP2基因保守區(qū)設(shè)計(jì)。

一種用于環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)犬細(xì)小病毒的試劑盒，其包括上述所述的引物組，也屬于本發(fā)明實(shí)施例保護(hù)的范圍。

本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述試劑盒還包括：Isothermal Master Mix試劑，購自北京晟泰勃科技有限公司；

陽性標(biāo)準(zhǔn)品，其以犬細(xì)小病毒病毒cDNA設(shè)計(jì)引物對(duì)擴(kuò)增得到的DNA片段，插入Blunt-zero載體連接，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，得到重組表達(dá)載體，以所述重組表達(dá)載體提取的質(zhì)粒為所述陽性標(biāo)準(zhǔn)品。