[發明專利]基于環介導恒溫擴增和微流控芯片生殖道支原體檢測方法

在審

• 申請號: 202010164224.1
• 申請日: 2020-03-11
• 公開（公告）號: CN111304346A
• 公開（公告）日: 2020-06-19
• 發明（設計）人: 張薇
• 申請（專利權）人: 重慶市第四人民醫院
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12Q1/6844;C12Q1/04;C12R1/35
• 代理公司: 重慶晶智匯知識產權代理事務所(普通合伙) 50229
• 代理人: 施永卿

本發明公開了一種基于環介導恒溫擴增和微流控芯片生殖道支原體檢測方法，屬于病原體檢測和診斷技術領域。包括以下步驟：引物設計;微流控芯片制作;恒溫擴增反應體系配制;芯片加樣;核酸擴增和結果判讀。本發明采用恒溫擴增技術和微流控芯片技術，利用具有鏈置換功能的聚合酶在63℃恒溫條件下進行反應，使用熒光染料摻入法進行實時熒光檢測，擴增陽性的樣品會產生類似實時熒光的“S”形擴增曲線。成功制備的四種生殖道支原體的微流控芯片具有較好的靈敏度、特異性和準確性，整個檢測過程在1h內即可完成。Uu、Mg、Mh的最低檢測限為1000拷貝/μL，而Up的最低檢測限為5000拷貝/μL,在臨床上具有廣泛的應用前景。

技術領域

本發明涉及病原體檢測和診斷技術領域，尤其涉及一種基于環介導恒溫擴增和微流控芯片生殖道支原體檢測方法。

背景技術

支原體是一類大小介于細菌與病毒之間、缺乏細胞壁、呈高度多形性、能通過濾菌器、可用人工培養基培養增殖的最小原核細胞型微生物。目前已發現與生殖道感染有關的支原體主要有解脲脲原體(Ureaplasma urealyticum，Uu)、微小脲原體(Ureaplasmaparvum，Up)，人型支原體(Mycoplasma hominis，Mh)、生殖支原體(Mycoplasmagenitalium，Mg)。液體培養法是前國內醫療機構對Uu和Mh的主要檢測手段，該法具有操作簡便，快速經濟，肉眼即可觀察，同時進行多種抗生素藥敏試驗的優點。但該法可能會受到細菌或真菌的污染造成假陽性，或標本中混有的產酸微生物對pH的改變產生干擾造成假陰性。Up和Mg在體外分離培養難度大，在液體培養基中不生長，在固體培養基上菌落大小極不一致，因此不推薦使用培養方法，目前主要靠DNA探針和PCR技術進行檢測。血清學檢測方法，如凝集反應、酶聯免疫吸附試驗(ELISA)等，用于檢測生殖道支原體的血清學變化。這些方法雖然有助于生殖道支原體致病作用的研究，但在臨床工作中這些血清學試驗沒有實用性。盡管針對生殖道支原體的檢測方法日益豐富，但是從技術成熟度以及實驗成本等方面綜合來看，目前仍沒有一項完美的技術能夠投入應用到臨床診斷中去。

環介導恒溫擴增(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是近年來發展的一種用于快速診斷的核酸體外擴增技術，具有操作簡便等優點。微流控技術是在微米尺寸的管道中處理納升至阿升體積微小流體的技術，具有微型化、集成化等特征，臨床診斷儀器和體外仿生模型是微流控芯片在生物醫學領域中兩個重要的應用方向。李艷燕等作者報道呼吸道病原體核酸恒溫擴增芯片十三聯檢具有覆蓋面廣、靈敏度高等優點，可快速準確地鑒定下呼吸道感染常見病原體。本發明旨在結合LAMP技術和微流控技術構建一種基因芯片用于生殖道支原體的快速鑒定。

發明內容

有鑒于此，本發明的目的在于提供一種基于環介導恒溫擴增和微流控芯片生殖道支原體檢測方法，可快速、準確檢測解脲脲原體(Uu)、微小脲原體(Up)、生殖支原體(Mg)和人型支原體(Mh)四種生殖道支原體。

為達到上述目的，本發明提供如下技術方案：

基于環介導恒溫擴增和微流控芯片生殖道支原體檢測方法,包括以下步驟：

(1)引物設計；從公共數據庫中獲得Uu、Up、Mh、Mg四種支原體的功能基因序列，用Muscle進行多序列比對，結合工具得到consensus序列；以consensus序列為輸入，結合工具剪切得到滿足要求的引物序列；以剪切得到的引物序列做blast比對，結合工具得到初步的引物篩選結果，利用公共數據庫進行進一步的引物篩選和特異性檢測，得到最后的引物集；

(2)微流控芯片制作；所述微流控芯片為碟式芯片，所述芯片固定有步驟(1)所述的生殖道支原體引物；

(3)恒溫擴增反應體系配制；將恒溫擴增試劑于室溫解凍、融化，搖勻并離心；在體系區，吸取9.0μL恒溫擴增試劑加入200μL離心管中，并移至PCR模板加樣區；在PCR模板加樣區，加入9.0μL被檢樣品或者對照品的DNA，搖勻并離心；