[發明專利]一種自然殺傷細胞體外培養方法

有效

• 申請號: 202010163641.4
• 申請日: 2020-03-10
• 公開（公告）號: CN111286488B
• 公開（公告）日: 2021-04-02
• 發明（設計）人: 王小奇;張曉盈;黃睿龍;蘇琳琳;孫向東
• 申請（專利權）人: 河南僑創生命科技有限公司
• 主分類號: C12N5/0783
• 分類號: C12N5/0783
• 代理公司: 鄭州芝麻知識產權代理事務所(普通合伙) 41173
• 代理人: 郭尊言

本發明涉及生物制藥技術領域，具體涉及一種自然殺傷細胞體外培養方法，該方法將整個培養過程分為誘導培養和增殖培養兩個階段，誘導培養采用透明質酸和CD16抗體對培養瓶預包被，培養過程中加入維生素E和槲皮素；增殖培養采用芝麻素和RetroNectin對培養瓶預包被，培養過程中加入谷胱甘肽和卟啉?α；培養瓶的包被成分、添加的助劑成分與各階段培養基中的有效成分相互配合作用，協同增效促進NK細胞的活化和增殖，在提高NK細胞的擴增效率的同時，提高NK細胞的活性。

技術領域

本發明涉及生物制藥技術領域，具體涉及一種自然殺傷細胞體外培養方法。

背景技術

人體免疫系統是由一個復雜的機制調節的，當免疫系統發生異常時，可能會引起免疫系統的失衡，并可能發生癌癥等各種難治療的疾病。因此，免疫細胞療法的發展成為人們關注的焦點，它是一種通過緩解免疫系統失衡并恢復正常狀態來治療免疫相關疾病的方法。

自然殺傷細胞（NK）是人體免疫細胞的一種，來源于骨髓淋巴細胞。在人體中，NK細胞主要分布在外周血和脾臟中，大致占外周血淋巴細胞的5%~15%；同時，也少量存在于淋巴結等其他組織中。NK細胞相對于其他類型的淋巴細胞，具有其自身的獨特性質。其最重要的特性是NK細胞不表達特異性抗原識別受體。因此，NK細胞在殺傷靶細胞的過程中，不需要通過特異性的機制識別靶細胞，是人體快速抵抗外源物質入侵的第一道防線，可以廣譜地殺滅各種病原物。同時，NK細胞的殺傷作用不受主要組織相容性復合體的限制，可以對多種腫瘤細胞迅速殺傷和溶解。近年來有大量的臨床研究表明NK細胞在抵抗腫瘤和病毒感染方面具有非常重要的作用。

由于在外周血淋巴細胞中NK細胞含量只有10%左右，因此在臨床應用的NK細胞通常需要通過體外培養的方法進行擴大培養以滿足臨床用量。體外培養常規方法是采用高劑量IL-2擴增NK細胞，只能擴增幾十倍，并且需要抽取患者大量的外周血，才能夠達到治療所需的細胞數量。因此，近年來，人們針對提高NK細胞體外培養效率進行了大量的研究，包括在培養基中加入IL-5、IL-21、GM-CSF等誘導因子和增值因子。這些針對培養基改進的方式雖然在一定程度上提高了NK細胞的擴增效率，但是將體外培養的NK細胞注射如體內發揮其免疫功能還需要確保NK細胞具有高的活性。由此，如何在提高NK細胞提高擴增效率的同時，防止細胞死亡和老化，保持細胞的活性，成為了目前亟待解決的技術問題。

發明內容

為了克服現有技術的缺陷，本發明的目的是提供一種自然殺傷細胞體外培養方法，具有高的擴增效率，保持細胞活性。

為了實現上述目的，本發明采用的技術方案如下：

一種自然殺傷細胞體外培養方法，包括以下操作步驟：

1）制備單個核細胞懸浮液：

將分離獲得外周血單個核細胞重懸于誘導培養基中，得到單個核細胞懸浮液；

2）誘導培養：

在培養瓶中加入透明質酸和CD16抗體對培養瓶進行包被，作為誘導培養用培養瓶；將步驟1）的單個核細胞懸浮液接種至誘導培養用培養瓶中，培養24小時，培養過程中及時補充誘導培養基，并且每間隔6小時，向培養瓶中加入維生素E和槲皮素，獲得誘導培養懸浮液；

3）增殖培養：

在新的培養瓶中加入芝麻素和RetroNectin對培養瓶進行包被，作為增殖培養用培養瓶；將步驟2）獲得的誘導培養懸浮液接種至增殖培養用培養瓶中，在增殖培養基環境下培養14天，培養過程中及時補充增殖培養基，并且每間隔2~3天，向培養瓶中加入谷胱甘肽和卟啉-α，即完成；

其中誘導培養基的組成包括基礎培養基、IL-2、IL-5、自體血清、氨基酸；增殖培養基的組成包括基礎培養基、IL- 15、GM-CSF、自體血清、氨基酸。