[發明專利]一種自然殺傷細胞體外培養方法

有效

• 申請號: 202010163641.4
• 申請日: 2020-03-10
• 公開（公告）號: CN111286488B
• 公開（公告）日: 2021-04-02
• 發明（設計）人: 王小奇;張曉盈;黃睿龍;蘇琳琳;孫向東
• 申請（專利權）人: 河南僑創生命科技有限公司
• 主分類號: C12N5/0783
• 分類號: C12N5/0783
• 代理公司: 鄭州芝麻知識產權代理事務所(普通合伙) 41173
• 代理人: 郭尊言

1.一種自然殺傷細胞體外培養方法，其特征在于，包括以下操作步驟：

1)制備單個核細胞懸浮液：

將分離獲得外周血單個核細胞重懸于誘導培養基中，得到單個核細胞懸浮液；

2)誘導培養：

在培養瓶中加入透明質酸和CD16抗體對培養瓶進行包被，作為誘導培養用培養瓶；將步驟1)的單個核細胞懸浮液接種至誘導培養用培養瓶中，培養24小時，培養過程中及時補充誘導培養基，并且每間隔6小時，向培養瓶中加入維生素E和槲皮素，獲得誘導培養懸浮液；

3)增殖培養：

在新的培養瓶中加入芝麻素和RetroNectin對培養瓶進行包被，作為增殖培養用培養瓶；將步驟2)獲得的誘導培養懸浮液接種至增殖培養用培養瓶中，在增殖培養基環境下培養14天，培養過程中及時補充增殖培養基，并且每間隔2～3天，向培養瓶中加入谷胱甘肽和卟啉-α，即完成；

其中誘導培養基的組成包括基礎培養基、IL-2、IL-5、自體血清、氨基酸；增殖培養基的組成包括基礎培養基、IL-15、GM-CSF、自體血清、氨基酸。

2.如權利要求1所述的自然殺傷細胞體外培養方法，其特征在于，步驟2)中在培養瓶中加入透明質酸和CD16抗體對培養瓶進行包被的具體方法包括取生理鹽水，加入透明質酸和CD16抗體，配置成含有3～6mg/ml透明質酸和5～8μg/mlCD16抗體的包被液，在培養瓶中加入5～10ml的PBS、1～2ml的包被液，4℃過夜后，棄去包被液，用PBS洗滌，即完成。

3.如權利要求1所述的自然殺傷細胞體外培養方法，其特征在于，步驟3)中在培養基中加入芝麻素和RetroNectin對培養瓶進行包被的具體方法包括取生理鹽水，加入芝麻素和RetroNectin，配置成含有50～60μg/ml芝麻素和5～8μg/mlRetroNectin的包被液，在培養瓶中加入5～10ml的PBS、1～2ml的包被液，4℃過夜后，棄去包被液，用PBS洗滌，即完成。

4.如權利要求1所述的自然殺傷細胞體外培養方法，其特征在于，誘導培養基的具體組成為：DMEM培養基，5％自體血清，1%谷氨酰胺，1％非必需氨基酸，500～750IU/ml IL-2，35～60mg/ml IL-5，所述非必需 氨基酸為絲氨酸和丙氨酸。

5.如權利要求4所述的自然殺傷細胞體外培養方法，其特征在于，增殖培養基的具體組成為：Cellgro-SCGM培養基，5％自體血清，1%谷氨酰胺，1％非必需氨基酸，25～50ng/mlIL-15，0.5～1μg/mlGM-CSF，所述非必需 氨基酸為絲氨酸和丙氨酸。

6.如權利要求1所述的自然殺傷細胞體外培養方法，其特征在于，步驟2)中根據培養瓶中培養基的體積，向培養瓶中加入維生素E的用量為10～20mg/ml，加入槲皮素的用量為15～20μg/ml。

7.如權利要求1所述的自然殺傷細胞體外培養方法，其特征在于，步驟3)中根據培養瓶中培養基的體積，向培養瓶中加入谷胱甘肽的用量為5～10μg/ml，加入卟啉-α的用量為0.6～1μg/ml。

8.如權利要求1所述的自然殺傷細胞體外培養方法，其特征在于，步驟1)制備單個核細胞懸浮液的具體方法包括無菌采外周血，用緩沖液稀釋外周血后，加入Ficoll分離液，離心后洗滌，得到外周血單個核細胞，將外周血單個核細胞按照一定的濃度用誘導培養基進行重懸，即完成。