[發明專利]HLA亞型檢測試劑盒及其應用

在審

• 申請號: 202010162878.0
• 申請日: 2020-03-10
• 公開（公告）號: CN111235266A
• 公開（公告）日: 2020-06-05
• 發明（設計）人: 廖衛平;石弈武
• 申請（專利權）人: 廣州醫科大學附屬第二醫院
• 主分類號: C12Q1/6883
• 分類號: C12Q1/6883;C12Q1/6881;C12Q1/6858
• 代理公司: 北京漢鼎理利專利代理事務所(特殊普通合伙) 11618
• 代理人: 潘滿根

本發明涉及HLA亞型檢測試劑盒，所述試劑盒包括用于檢測多種HLA亞型的多重PCR擴增的引物和探針，每對HLA亞型上游和下游引物的量比值為1:20到1:50，每對引物上游引物的Tm值比下游引物的Tm值高4?8℃。本發明結合通過提高限速引物的退火溫度，加上調整上下游引物的配比，能較傳統制備單鏈方法在不損失PCR擴增效率的情況下，制備出更多的單鏈，從而使得探針的雜交信號較傳統的多重單鏈制備PCR得到明顯的提升，從而提高了檢測的靈敏度和特異性。

技術領域

本發明涉及分子診斷領域，特別涉及HLA亞型檢測試劑盒及其應用。

背景技術

癲癇是神經科第二常見疾病，我國癲癇患者過千萬，每年新增約40萬，藥物治療為癲癇的主要治療方式，多數患者需要長期服藥，但大約16％的患者出現皮膚型過敏反應，包括輕度的斑丘疹(maculopapular exanthema,MPE)及重度的斯蒂文森-強生綜合癥(Stevens-Johnson syndrome，SJS)和中毒性表皮壞死松解癥(toxic epidermalnecrolysis，TEN)，明顯影響生活質量，嚴重時出現剝脫性皮炎，通常全身粘膜(眼、嘴、生殖器)潰瘍，皮膚起水皰，甚至出現全身表皮脫離，如同大面積燙傷，致死性高達40％。這種過敏在南方漢族人群，尤其是在廣東及周邊地區的漢族人群中發病率明顯高于其它地區及人群。

卡馬西平(CBZ)、拉莫三嗪(LTG)、奧卡西平(OXC)、苯妥英鈉(PHT)以及妥泰(PB)都具有相似的芳香族結構，是廣泛使用的用于控制癲癇、三叉神經痛等的抗癲癇藥物(AEDs)。然而，該類藥物通常會導致皮膚不良反應(cADRs)，長期困擾著臨床醫生。cADRs占所有報道的藥物不良反應的10％-30％，包括輕度的斑丘疹(MPE)、藥物超敏反應綜合癥(HSS)到重型的有潛在致命性的Stevens-Johnson綜合癥(SJS)和/或中毒性表皮壞死松解癥(Toxicepidermal necrolysis,TEN)。如能找到與其相關的基因標志，將對臨床用藥起到很大的指導作用。人類白細胞抗原(HLA)基因與人體免疫相關，包括數千個不同的基因型。HLA-B*15:02為我國南方漢族人群卡馬西平導致剝脫性皮炎的遺傳標記。HLA-A*24:02是卡馬西平導致剝脫性皮炎的風險基因，也是其它抗癲癇藥物導致剝脫性皮炎的通用風險基因，除了以上兩個，并且還存在其它HLA風險基因，包括HLA-A*02:01、HLA-B*15:01、HLA-B*13:01、HLA-B*15:01、HLA-B*15:11、HLA-B*35:01、HLA-B*38:02和DRB1*04:06，這些基因型可以解釋約90％的癲癇患者用藥過敏風險。因此癲癇患者可通過基因篩查降低甚至避免致死性皮膚型不良反應的發生，例如由于HLA-B*15：02明確為卡馬西平導致剝脫性皮炎的基因標記，2008年美國FDA已建議個體服用卡馬西平前進行HLA-B*15:02基因檢測，以避免剝脫性皮炎的發生。而HLA-A*24：02的發現，將卡馬西平導致剝脫性皮炎的排除概率從69.6％提高到82％；這些癲癇藥物的主要基因標記，將多個藥物導致剝脫性皮炎的排除概率達到90％，而且為其他人種及其它類型的皮膚型過敏提供通用遺傳標記，惠及的個體更多。個體特別是南方漢族人，服用芳香族抗癲癇藥物之前，檢測主要遺傳標記，醫生對攜帶主要遺傳標記的陽性個體慎用芳香族類抗癲癇藥物，降低甚至避免致死性皮膚型不良反應的發生。

發明內容

為了解決上述問題，本發明提供一種HLA亞型檢測試劑盒，所述試劑盒包括用于檢測多種HLA亞型的多重PCR擴增的引物和探針，每對HLA亞型的上游和下游引物的量比值為1:20到1:50，每對引物的上游引物的Tm值比下游引物的Tm值高4-8℃。

在一種實施方式中，每對HLA亞型的上游和下游引物的量比值為1:30到1:40。

在一種實施方式中，在所述上游引物5’端增加堿基GCG以提高所述上游引物的Tm值。