[發(fā)明專利]一種基因組整合外源序列的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202010152728.1
• 申請(qǐng)日: 2020-03-06
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN113355345B
• 公開(kāi)（公告）日: 2023-05-23
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 尹進(jìn);張倩;董一名;李騰;張浩千
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 深圳藍(lán)晶生物科技有限公司
• 主分類號(hào): C12N15/74
• 分類號(hào): C12N15/74;C12N15/90
• 代理公司: 北京金信知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11225
• 代理人: 徐琳;李維盈

1.一種適用于羅氏真氧菌的基于位點(diǎn)特異性重組酶的基因插入方法，包括以下步驟：

1）在羅氏真養(yǎng)菌的基因組上插入位點(diǎn)特異性重組酶Bxb1對(duì)應(yīng)的attB位點(diǎn)以構(gòu)建基因組上整合了attB序列的重組羅氏真氧菌，其中，所述羅氏真氧菌為Ralstonia?eutrophaH16；

2）構(gòu)建含有外源序列、位點(diǎn)特異性重組酶Bxb1基因、位點(diǎn)特異性重組酶Bxb1對(duì)應(yīng)的attP序列的重組載體，所述重組載體為無(wú)法在羅氏真氧菌中復(fù)制的質(zhì)粒載體，并且所述重組載體的骨架部分包含能在大腸桿菌S17-1中復(fù)制而不能在羅氏真氧菌中復(fù)制的復(fù)制子pMB1，以及所述重組載體的骨架部分還包含篩選標(biāo)記基因，所述篩選標(biāo)記基因?yàn)榭股乜剐曰颍?/p>

3）將步驟2）中構(gòu)建的所述重組載體轉(zhuǎn)入大腸桿菌S17-1中，再通過(guò)接合轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)入步驟1）中構(gòu)建的所述重組羅氏真氧菌中，利用所述位點(diǎn)特異性重組酶Bxb1介導(dǎo)attB和attP序列之間的重組，從而將所述重組載體整合到所述重組羅氏真氧菌的基因組上，

其中，步驟1）中，所述位點(diǎn)特異性重組酶Bxb1對(duì)應(yīng)的attB位點(diǎn)的序列如SEQ?ID?NO:?10所示；步驟2）中，所述位點(diǎn)特異性重組酶Bxb1的氨基酸序列如SEQ?ID?NO:?21所示，所述位點(diǎn)特異性重組酶Bxb1對(duì)應(yīng)的attP序列如SEQ?ID?NO:?22所示。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，步驟2）中，所述抗生素抗性基因選自卡那霉素抗性基因、四環(huán)素抗性基因、鏈霉素抗性基因和壯觀霉素抗性基因中的一種或多種。

3.?根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，步驟2）中，所述位點(diǎn)特異性重組酶Bxb1基因的核苷酸序列如SEQ?ID?NO:?20所示。

4.一種適用于羅氏真氧菌的基于位點(diǎn)特異性重組酶的基因插入方法，包括以下步驟：

a）在羅氏真養(yǎng)菌的基因組上插入位點(diǎn)特異性重組酶Bxb1對(duì)應(yīng)的attB位點(diǎn)以構(gòu)建基因組上整合了attB序列的重組羅氏真氧菌，其中，所述羅氏真氧菌為Ralstonia?eutrophaH16；

b）構(gòu)建含有氨基酸序列如SEQ?ID?NO:?43所示的VCre重組酶基因的重組載體，該步驟中的重組載體為能在羅氏真氧菌中復(fù)制的質(zhì)粒載體，并且所述重組載體的骨架部分包含既能在大腸桿菌S17-1中復(fù)制也能在羅氏真氧菌中復(fù)制的復(fù)制子pBBR1，以及該步驟中的重組載體的骨架部分還包含篩選標(biāo)記基因，所述篩選標(biāo)記基因?yàn)榭股乜剐曰颍?/p>

c）構(gòu)建含有外源序列、位點(diǎn)特異性重組酶Bxb1基因、位點(diǎn)特異性重組酶Bxb1對(duì)應(yīng)的attP序列、2個(gè)能夠被步驟b）中的VCre重組酶特異性識(shí)別的VloxP序列的重組載體，其中，所述外源序列和所述attP序列在所述2個(gè)VloxP序列之間，所述位點(diǎn)特異性重組酶Bxb1基因不在所述2個(gè)VloxP序列之間，該步驟中的重組載體為無(wú)法在羅氏真氧菌中復(fù)制的質(zhì)粒載體，并且該步驟中的重組載體的骨架部分包含能在大腸桿菌S17-1中復(fù)制而不能在羅氏真氧菌中復(fù)制的復(fù)制子pMB1，以及該步驟中的重組載體的骨架部分還包含篩選標(biāo)記基因，所述篩選標(biāo)記基因?yàn)榭股乜剐曰颍?/p>

d）將步驟c）中構(gòu)建的所述重組載體轉(zhuǎn)入大腸桿菌S17-1中，再通過(guò)接合轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)入步驟a）中構(gòu)建的所述重組羅氏真氧菌中，利用所述位點(diǎn)特異性重組酶Bxb1介導(dǎo)attB和attP序列之間的重組，從而將步驟c）的所述重組載體整合到所述重組羅氏真氧菌的基因組上；

e）將步驟b）中構(gòu)建的所述重組載體轉(zhuǎn)入大腸桿菌S17-1中，再通過(guò)接合轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)入步驟d）得到的基因組上整合了步驟c）所述重組載體的重組羅氏真氧菌中，從而將步驟c）所述重組載體的骨架部分從重組羅氏真氧菌的基因組上刪除，

其中，步驟a）中，所述位點(diǎn)特異性重組酶Bxb1對(duì)應(yīng)的attB位點(diǎn)的序列如SEQ?ID?NO:?10所示；步驟c）中，所述位點(diǎn)特異性重組酶Bxb1基因的氨基酸序列如SEQ?ID?NO:?21所示，所述位點(diǎn)特異性重組酶Bxb1對(duì)應(yīng)的attP序列如SEQ?ID?NO:?22所示，以及所述VloxP序列如SEQ?ID?NO:?45所示。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中，步驟b）中，所述抗生素抗性基因選自卡那霉素抗性基因、四環(huán)素抗性基因、鏈霉素抗性基因和壯觀霉素抗性基因中的一種或多種。