[發(fā)明專利]明膠作為重組家蠶乙酰膽堿酯酶保護劑的應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202010152073.8
• 申請日: 2020-03-06
• 公開（公告）號: CN111593041B
• 公開（公告）日: 2022-05-31
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 王弘;蔡俊;李家冬;李麗萍
• 申請（專利權(quán)）人: 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號: C12N9/96
• 分類號: C12N9/96;C12N9/18
• 代理公司: 廣州粵高專利商標代理有限公司 44102
• 代理人: 段卉

本發(fā)明公開了明膠作為重組家蠶乙酰膽堿酯酶保護劑的應(yīng)用，本發(fā)明利用明膠作為重組家蠶乙酰膽堿酯酶的保護劑，其能夠很好的保持重組家蠶乙酰膽堿酯酶的酶活，利用其制備了純高穩(wěn)定性的重組家蠶乙酰膽堿酯酶液體制劑和凍干粉制劑，其儲存穩(wěn)定性顯著優(yōu)于無保護劑的酶制劑。該兩種含有保護劑的酶制劑對于重組家蠶乙酰膽堿酯酶在酶法檢測農(nóng)藥殘留的實際應(yīng)用具有重大意義和推廣價值。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及酶法檢測農(nóng)藥殘留領(lǐng)域，更具體的，涉及明膠作為重組家蠶乙酰膽堿酯酶保護劑的應(yīng)用。

背景技術(shù)

乙酰膽堿酯酶是酶法檢測農(nóng)藥殘留的核心試劑，是一種絲氨酸水解酶，因其能夠被有機磷類和氨基甲酸酯類農(nóng)藥抑制而被應(yīng)用于對食品、農(nóng)產(chǎn)品的農(nóng)藥殘留檢測中。被抑制后的酶會失去對底物水解的能力，導(dǎo)致顯色劑顏色變化減弱，因此可以計算出待測樣品中的農(nóng)藥殘留量。酶法檢測具有廣譜和速效的特點，廣泛應(yīng)用于農(nóng)產(chǎn)品農(nóng)藥殘留的現(xiàn)場初篩。乙酰膽堿酯酶廣泛存在于電鰩、電鰻、人、家蠅、果蠅、家蠶等動物、昆蟲的血液或組織中。其中家蠶由于長期人工圈養(yǎng)而對農(nóng)藥具有高敏感性，其乙酰膽堿酯酶的研究也受到關(guān)注。獲取乙酰膽堿酯酶的途徑主要包括直接提取和基因工程重組表達，目前應(yīng)用較多的為直接提取，其弊端在于提取率低、純化程度差、酶靈敏度各異，在農(nóng)藥殘留檢測的實際應(yīng)用中往往容易造成靈敏度低、假陽性等各種問題。相較之下，利用不同的表達系統(tǒng)進行乙酰膽堿酯酶的重組表達有助于獲取大量、廉價的酶源，同時可以通過加入標簽蛋白進行親和純化，獲得的純化酶純度高、活性好，利于進一步的研究和應(yīng)用。

酶的穩(wěn)定性包括熱穩(wěn)定性和儲存穩(wěn)定性是影響其實際應(yīng)用的重要因素之一，提高酶的穩(wěn)定性方法多種多樣，包括分子進化、添加保護劑或分子伴侶、化學(xué)修飾以及固定化處理等。添加保護劑是最為便捷、廉價和實用的方法，常用的保護劑包括醇類、糖類、鹽類、聚合物、有機溶劑等。通過篩選針對目標酶的保護劑類型，可以開發(fā)單一型或復(fù)合型保護劑，有效提高酶的穩(wěn)定性。酶制劑的類型通常有液體制劑和凍干粉制劑。酶的液體制劑制備、儲存和使用方便，避免了凍干和復(fù)溶時對酶造成的損害和損失，但液體酶制劑容易出現(xiàn)結(jié)構(gòu)損壞、聚集、降解等不良情況。配合保護劑將酶制備成凍干粉制劑，能夠使酶的結(jié)構(gòu)保持穩(wěn)定，提高酶在不同溫度下的儲存穩(wěn)定性。

在重組家蠶乙酰膽堿酯酶用于農(nóng)藥殘留檢測的研究中，該酶的活性和靈敏度較好，但其穩(wěn)定性差造成了應(yīng)用和儲藏的不便，限制了其實際應(yīng)用。目前尚未有一種針對重組家蠶乙酰膽堿酯酶的保護劑，制約了其的應(yīng)用。因此，針對該酶進行保護劑的篩選研究具有重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供明膠作為重組家蠶乙酰膽堿酯酶保護劑的應(yīng)用。

本發(fā)明的第一個目的在于提供明膠作為重組家蠶乙酰膽堿酯酶保護劑的應(yīng)用。

本發(fā)明的第二個目的在于提供明膠在制備高穩(wěn)定性乙酰膽堿酯酶液體制劑中的應(yīng)用。

本發(fā)明的第三個目的在于提供明膠在制備高穩(wěn)定性乙酰膽堿酯酶凍干粉制劑中的應(yīng)用。

本發(fā)明的第四個目的在于提供一種高穩(wěn)定性重組家蠶乙酰膽堿酯酶液體制劑。

本發(fā)明的第五個目的在于提供一種高穩(wěn)定性重組家蠶乙酰膽堿酯酶凍干粉制劑。

本發(fā)明的上述目的是通過以下方案予以實現(xiàn)的：

明膠作為重組家蠶乙酰膽堿酯酶保護劑的應(yīng)用。

優(yōu)選地，明膠的工作濃度為1～10g/L。

優(yōu)選地，明膠的工作濃度為5g/L。

優(yōu)選地，所述重組家蠶乙酰膽堿酯酶為由以下方法制備得到：畢赤酵母分泌表達的重組家蠶乙酰膽堿酯酶上清液作為粗酶液，經(jīng)Ni親和層析進行純化，并置換至50 mM磷酸鹽緩沖液中。

更優(yōu)選地，所述重組家蠶乙酰膽堿酯酶保護劑保護酶活。

本發(fā)明還要求保護以下內(nèi)容：