[發(fā)明專利]小麥全蝕病菌禾頂囊殼LAMP檢測引物組及方法

有效

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• 申請日: 2020-03-06
• 公開（公告）號: CN111088395B
• 公開（公告）日: 2023-02-03
• 發(fā)明（設計）人: 崔林開;胡艷紅;和志華;李夢琪;鄧俊麗
• 申請（專利權）人: 河南科技大學
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12Q1/6844;C12Q1/04;C12N15/11;C12R1/645
• 代理公司: 洛陽公信知識產權事務所(普通合伙) 41120
• 代理人: 時亞娟

本發(fā)明涉及小麥全蝕病菌禾頂囊殼LAMP檢測引物組及方法，屬于基因工程技術領域，本發(fā)明以該病原菌的ITS為靶序列，建立禾頂囊殼的LAMP檢測技術，采用的引物特異性強，反應體系的靈敏度高；通過對發(fā)病組織的檢測，所述反應體系能夠準確快速地從發(fā)病小麥組織中檢測出小麥全蝕病。該檢測方法簡單、快速和靈敏，并且不需要昂貴儀器，有利于在基層植保站大面積推廣和使用，為小麥全蝕病的早期、精準防控提供技術支持。

技術領域

本發(fā)明屬于基因工程技術領域，具體地，涉及小麥全蝕病菌禾頂囊殼LAMP檢測引物組及方法。

背景技術

河南省是全國重要的糧食生產基地，是我國最重要的小麥主產區(qū)。近年來，隨著免耕播種、小麥淺耕播種和秸稈還田等保護性耕作技術的實施以及機械化跨區(qū)作業(yè)，使得小麥土傳病害的發(fā)生面積不斷擴大。特別是小麥全蝕病，自1992 年在河南省發(fā)現(xiàn)以來，不斷傳播蔓延，近幾年來更是在全省呈現(xiàn)大爆發(fā)的趨勢，嚴重影響河南省小麥的安全生產。小麥全蝕病是由禾頂囊殼(Gaeumannomyces graminis)引起，危害小麥的根部和莖基部，嚴重時全田植株枯死，是小麥生產上的一種毀滅性土傳病害。此外還有小麥紋枯病和小麥根腐病也是小麥重要的土傳病害，但是這3種小麥土傳病害的早期癥狀容易混淆，為在病害發(fā)生早期能夠準確診斷病害，從而對癥下藥在病害發(fā)生的初期及時進行防治，達到事半功倍的效果，需要開發(fā)特異、敏度、快速的小麥全蝕病早期診斷技術。

環(huán)介導等溫擴增 (Loop mediated isothermal amplification，LAMP) 技術是一種恒溫體外核酸擴增技術。通過針對靶序列的６個區(qū)域設計一組４個特異引物，利用具有鏈置換活性的Bst DNA聚合酶，在60～65℃恒溫條件下60 min即可擴增出10⁹個靶序列。相比常規(guī)PCR檢測技術，該技術具有特異性強、靈敏度高、快速簡便且成本低廉的特點，已廣泛應用于病原微生物的檢測。

發(fā)明內容

為了解決現(xiàn)有技術中的問題，本發(fā)明的目的在于提供小麥全蝕病菌禾頂囊殼LAMP檢測引物組及方法，所述引物的特異性強，靈敏度高，能準確快速檢測小麥全蝕病，為小麥全蝕病的早期、精準防控提供技術支持。

為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的具體方案為：

小麥全蝕病菌禾頂囊殼LAMP檢測引物組，其特征在于：包括四條特異性引物，具體如下：

QS-FIP：CAGGGTTTGTAACCTCCGGCACATACCTTTACTGTTGCTTC；

QS-BIP：AACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTACTTATCGCATTTCGCTG；

QS-F3：AAACTCCAACCCCTGTGA；

QS-B3：ACTGAATTCTGCAATTCACA；

所述四個特異引物的靶標基因為小麥全蝕病菌禾頂囊殼的ITS。

本發(fā)明還提供利用所述LAMP檢測引物組對小麥全蝕病進行檢測的方法，包括以下步驟：

步驟一、提取基因組DNA：選取小麥植株的發(fā)病部位，提取基因組DNA，測定提取的基因組DNA的濃度和純度，作為模板DNA，備用；

步驟二、確定反應體系：每25μL反應體系中，由以下成分組成：2.5 μL 10×ThermoPol Buffer，1.5 μL 100 mM MgSO₄、3.5 μL 10 mM dNTPs、10 μM QS-FIP和QS-BIP各4 μL、10 μM QS-F3和QS-B3各0.5 μL、１μL 8000U/mL Bst DNA Polymerase和１μL模板DNA，滅菌超純水補足25 μL；