[發明專利]懸鈴木突變體、獲取懸鈴木突變體的方法和應用

有效

• 申請號: 202010144373.1
• 申請日: 2020-03-04
• 公開（公告）號: CN111424050B
• 公開（公告）日: 2022-02-22
• 發明（設計）人: 夏立新;于為常;駱超;周秋艷
• 申請（專利權）人: 深圳大學
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;C12N15/29;A01H5/00;A01H5/10;A01H6/00
• 代理公司: 深圳中一聯合知識產權代理有限公司 44414
• 代理人: 黃志云

1.一種獲得懸鈴木突變體的方法，其特征在于，包括以下步驟：

獲取懸鈴木目的基因并確定gRNA靶點序列；其中，所述gRNA靶點序列同時含有第一gRNA靶點序列和第二gRNA靶點序列，其中，所述第一gRNA靶點序列如SEQ ID No.1所示，為：5’-CAGCGCCGATATTGTTCAGG-3’；所述第二gRNA靶點序列如SEQ ID No.2所示，為：5’-TTCTGCGCGAAGTCTCTTGG-3’；

合成含限制性內切酶粘性末端的gRNA靶點序列寡核苷酸片段和及其互補鏈，混合退火后產生兩端含內切酶粘性末端的DNA退火產物；

提供CRISPR/Cas9載體質粒和限制性內切酶，采用所述限制性內切酶對所述CRISPR/Cas9載體質粒進行酶切處理得到酶切后的CRISPR/Cas9載體質粒；

提供連接酶，采用所述連接酶依次將所述酶切后的CRISPR/Cas9載體質粒、所述DNA退火產物進行連接處理得到CRISPR/Cas9基因組編輯載體；所述CRISPR/Cas9基因組編輯載體含有第一gRNA靶點序列退火產物和第二gRNA靶點序列退火產物；

采用基因槍法將所述CRISPR/Cas9基因組編輯載體轉化至種子胚中得到轉化產物，對所述轉化產物進行培育，篩選懸鈴木突變體。

2.根據權利要求1所述的獲得懸鈴木突變體的方法，其特征在于，采用基因槍法將所CRISPR/Cas9基因組編輯載體轉化至種子胚中得到轉化產物的方法中，包括如下步驟：

獲取植物成熟期果實種子，培育出胚芽；

提供待轉化質粒載體，所述待轉化質粒載體包括所述植物基因組編輯載體以及攜帶所述植物基因組編輯載體的金屬微粒；其中，所述金屬微粒的直徑為0.6 μm~1.8 μm；

采用基因槍，在壓力為450~2200 PSI的條件下將所述待轉化質粒載體轉化至所述胚芽中，得到轉化產物。

3.根據權利要求2所述的獲得懸鈴木突變體的方法，其特征在于，提供待轉化質粒載體的步驟中，按照所述金屬微粒與所述植物基因組編輯載體的質量比為15 mg: 2 μg進行包被，制備得到所述待轉化質粒載體。

4.根據權利要求2所述的獲得懸鈴木突變體的方法，其特征在于，采用基因槍，在壓力為450~2200 PSI的條件下將所述待轉化質粒載體轉化至所述胚芽中的步驟中，所述待轉化質粒載體用于轉化100~500個胚芽的比例進行轉化。

5.根據權利要求1或2所述的獲得懸鈴木突變體的方法，其特征在于，所述CRISPR/Cas9載體質粒包括pKSE401；和/或，

所述限制性內切酶包括BsaI酶。

6.根據權利要求1或2所述的獲得懸鈴木突變體的方法，其特征在于，獲取懸鈴木目的基因的步驟中，所述懸鈴木目的基因為懸鈴木花粉過敏原plaa1基因，采用第五引物和第六引物進行PCR擴增反應得到所述懸鈴木花粉過敏原plaa1基因，其中，所述第五引物的序列如SEQ ID No.3所示，為：5’-tacgcggggaacaaaacaatccaat-3’；所述第六引物的序列如SEQID No.4所示，為：5’- ccgaagagggccaaatatcataca-3’。