[發(fā)明專利]BNIP3的pSer131多克隆抗體及其制備方法和應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202010140528.4
• 申請(qǐng)日: 2020-03-03
• 公開（公告）號(hào): CN111363031B
• 公開（公告）日: 2022-03-11
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 吳麗穎;朱玲玲;何云凌;鞏生輝;成祥;趙永岐;趙名;趙彤;范明
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國人民解放軍軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院
• 主分類號(hào): C07K14/82
• 分類號(hào): C07K14/82;C07K16/44;C07K16/32;C07K16/06;C07K1/22;G01N33/574
• 代理公司: 北京成實(shí)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11724
• 代理人: 葉立濤

本發(fā)明公開了一種BNIP3蛋白Ser131位點(diǎn)磷酸化抗體及其制備方法和應(yīng)用。所述抗原合成肽的氨基酸序列為SSHCD(S?p)PPRSQ，磷酸化位點(diǎn)為BNIP3蛋白的第131位絲氨酸。本發(fā)明的BNIP3蛋白S131位點(diǎn)磷酸化抗體不僅能夠識(shí)別外源過表達(dá)的磷酸化的BNIP3，還能識(shí)別細(xì)胞內(nèi)源性磷酸化的BNIP3，此外還能運(yùn)用于BNIP3蛋白穩(wěn)定性、線粒體自噬及細(xì)胞凋亡判定中。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于抗體制備的生物醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種BNIP3蛋白Ser131位點(diǎn)磷酸化抗體及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)

BNIP3是線粒體外膜蛋白，屬于BCL-2家族，早期研究發(fā)現(xiàn)BNIP3在調(diào)控細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要作用，近年更多的證據(jù)表明BNIP3可以作為一種受體介導(dǎo)線粒體自噬。在大鼠原代培養(yǎng)的心肌細(xì)胞和多種腫瘤細(xì)胞系中，曾觀察到BNIP3能被磷酸化修飾，然而磷酸化位點(diǎn)和相應(yīng)功能沒有得到解答。Zhu等在2013年通過位點(diǎn)突變發(fā)現(xiàn)BNIP3的Ser17和Ser24位點(diǎn)磷酸化對(duì)于BNIP3介導(dǎo)線粒體自噬具有重要作用，但針對(duì)該位點(diǎn)的激酶至今還未發(fā)現(xiàn)，表明這兩個(gè)位點(diǎn)的磷酸化未必真實(shí)。因此，有必要進(jìn)一步研究新的磷酸化位點(diǎn)，并研發(fā)出一種BNIP3蛋白磷酸化抗體，來探索BNIP3在介導(dǎo)線粒體自噬或細(xì)胞凋亡中的調(diào)控作用。

另一方面，在更早期的研究中就觀察到BNIP3能被快速降解，后來發(fā)現(xiàn)BNIP3能通過泛素-蛋白酶體途徑降解。通常，蛋白的泛素化與磷酸化密切相關(guān)，但BNIP3磷酸化對(duì)于其泛素化降解具有怎樣的調(diào)控作用尚不明確。因此，有必要研發(fā)出一種BNIP3蛋白磷酸化抗體，來探明BNIP3磷酸化對(duì)其泛素化降解的精準(zhǔn)調(diào)控。目前國內(nèi)外市場上缺乏可用于研究內(nèi)源性磷酸化的BNIP3抗體，因而無法開展相關(guān)研究與應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種BNIP3第131位絲氨酸磷酸化的多克隆抗體及其制備方法和應(yīng)用。

一種BNIP3蛋白磷酸化抗體的抗原合成肽，所述抗原合成肽的氨基酸序列為SSHCD(S-p)PPRSQ，磷酸化位點(diǎn)為BNIP3蛋白的第131位絲氨酸。

一種BNIP3蛋白磷酸化抗體的制備方法，包括以下步驟：

1)將上述的抗原合成肽通過與載體蛋白進(jìn)行偶聯(lián)，得到抗原；

2)利用步驟1)所述抗原對(duì)動(dòng)物進(jìn)行免疫，并收集抗血清；

3)將步驟2)所述抗血清使用合成的修飾肽進(jìn)行親和柱分離純化后，得到BNIP3蛋白Ser131位點(diǎn)磷酸化抗體。

優(yōu)選的，所述步驟2)免疫方式具體為：1次引發(fā)注射和4次加強(qiáng)注射；所述引發(fā)注射和加強(qiáng)注射均為：將抗原合成肽與佐劑聯(lián)合免疫動(dòng)物，在頸部、背部皮膚較薄且松弛的部位兩側(cè)皮下注射，臀肌與大腿部兩側(cè)分別肌肉注射，腰部兩側(cè)皮內(nèi)注射，爪墊注射。

優(yōu)選的，所述步驟3)中，純化通過以下步驟實(shí)施：以斑點(diǎn)印跡實(shí)驗(yàn)(Dot blot)測定純化前的抗血清針對(duì)抗原的效價(jià)，確定純化前的抗血清是否能特異性能識(shí)別抗原；利用親和分離-親和純化循環(huán)技術(shù)對(duì)收集的抗血清進(jìn)行純化，即為BNIP3第131位絲氨酸磷酸化的多克隆抗體。

上述的BNIP3蛋白磷酸化抗體用于斑點(diǎn)印跡檢測的用途。

上述的BNIP3蛋白磷酸化抗體用于免疫印跡檢測的用途。

上述的BNIP3蛋白磷酸化抗體用于檢測細(xì)胞外源過表達(dá)磷酸化的BNIP3的用途。

上述的BNIP3蛋白磷酸化抗體用于檢測細(xì)胞內(nèi)源表達(dá)磷酸化的BNIP3的用途。