[發(fā)明專利]一株產(chǎn)L-異亮氨酸的谷氨酸棒狀桿菌工程菌

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202010129934.0
• 申請(qǐng)日: 2020-02-28
• 公開（公告）號(hào): CN111321100B
• 公開（公告）日: 2022-03-25
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王小元;張炎潮;柳亞迪;胡曉清
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 江南大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N1/21
• 分類號(hào): C12N1/21;C12N15/77;C12P13/06;C12R1/15
• 代理公司: 哈爾濱市陽光惠遠(yuǎn)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 23211
• 代理人: 彭素琴

本發(fā)明涉及一株產(chǎn)L?異亮氨酸的谷氨酸棒狀桿菌工程菌，屬于基因工程和發(fā)酵工程技術(shù)領(lǐng)域。該菌株以L?異亮氨酸工業(yè)生產(chǎn)菌WM001為基礎(chǔ)，通過基因敲除、過表達(dá)等手段對(duì)其L?異亮氨酸合成代謝途徑進(jìn)行改造，最終得到的菌株WM005/pYCW?1?ilvBN?ppnK能夠穩(wěn)定遺傳，且在制備L?異亮氨酸過程中無需添加抗生素，減少了產(chǎn)生耐藥性菌株的風(fēng)險(xiǎn)，制備得到的L?異亮氨酸適合醫(yī)療、化妝品、工業(yè)等各個(gè)領(lǐng)域的生產(chǎn)，不會(huì)因?yàn)榭股囟斐僧a(chǎn)品的污染；在5L發(fā)酵罐補(bǔ)料分批發(fā)酵中積累32.1g/L的L?異亮氨酸，糖酸轉(zhuǎn)化率達(dá)到0.181g/g，適用于L?異亮氨酸的工業(yè)化生產(chǎn)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明構(gòu)建一株產(chǎn)L-異亮氨酸的谷氨酸棒狀桿菌工程菌，屬于基因工程和發(fā)酵工程技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

L-異亮氨酸是人體必需的三種支鏈氨基酸(BCAA)之一，在各種工業(yè)應(yīng)用中用于生產(chǎn)各種產(chǎn)品，例如人類營養(yǎng)增強(qiáng)劑，動(dòng)物飼料添加劑，醫(yī)療產(chǎn)品成分和化妝品成分。L-異亮氨酸主要通過微生物發(fā)酵生產(chǎn)，而大腸桿菌和谷氨酸棒狀桿菌是主要的生產(chǎn)菌株。但是，大腸桿菌通常會(huì)合成內(nèi)毒素，這可能會(huì)污染產(chǎn)品。因此，谷氨酸棒狀桿菌成為生產(chǎn)L-異亮氨酸的理想菌株。

在谷氨酸棒狀桿菌中，由于L-異亮氨酸與其他氨基酸相互交織合成：從L-天冬氨酸開始，由十個(gè)反應(yīng)步驟組成的L-異亮氨酸生物合成途徑是復(fù)雜的。因此，L-異亮氨酸的生產(chǎn)是比較困難的。L-異亮氨酸生物合成途徑中有十種關(guān)鍵酶分別為天冬氨酸激酶(AK)，半醛脫氫酶(ASD)，高絲氨酸脫氫酶(HD)，高絲氨酸激酶(HK)，蘇氨酸合酶(TS)，蘇氨酸脫水酶(TD)，乙酰羥酸合酶(AHAS)，乙酰羥酸異構(gòu)酶(AHAIR)，羥酸脫水酶(DHAD)和支鏈氨基酸轉(zhuǎn)氨酶(TA)，它們分別由基因lysC，asd，hom，thrB，thrC，ilvA，ilvBN，ilvC，ilvD和ilvE編碼。從理論上講，TD(ilvA基因編碼)和AHAS(ilvBN基因編碼)在這些酶中更為重要，TD催化形成L-異亮氨酸生物合成的關(guān)鍵前體物質(zhì)——2-酮丁酸；AHAS在平衡谷氨酸棒狀桿菌細(xì)胞中L-纈氨酸和L-異亮氨酸的水平方面起著重要作用，它可以催化兩個(gè)丙酮酸分子的縮合，導(dǎo)致L-纈氨酸的合成，或者丙酮酸和2-酮丁酸的縮合，導(dǎo)致L-異亮氨酸合成。

實(shí)驗(yàn)室早期研究，已經(jīng)通過質(zhì)粒載體過表達(dá)lrp，brnFE，ilvBN，ilvA和ppnK來構(gòu)建生產(chǎn)L-異亮氨酸的谷氨酸棒狀桿菌菌株，但在發(fā)酵過程中必須添加抗生素如卡那霉素，維持帶有這些基因的質(zhì)粒。參考以下文章：

1.Yin L,Hu X,Wang X,et al.Co-xpression of feedback-resistantthreonine dehydratase and acetohydroxy acid synthase increases L-isoleucineproduction in Corynebacterium glutamicum.2012,MetabEng

2.Yin L,Shi F,Wang X et al.Increasing L-isoleucine production inCorynebacterium glutamicumbyoverexpressing global regulator Lrp and two-component export system BrnFE.2013,J Appl Microbiol

3.Yin L,Zhao J,Wang X,et aL Increasing L-isoleucine production inCorynebacterium glutamicum byenhancing the carbon flux in its biosynthesispathway and NADPH supply.2013,BioprocBiotechnol Engineer