[發(fā)明專利]一種糖化酶突變體及其應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202010124805.2
• 申請日: 2020-02-27
• 公開（公告）號: CN111269904B
• 公開（公告）日: 2022-06-21
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 黎明;路福平;吳佳婧
• 申請（專利權(quán)）人: 天津科技大學
• 主分類號: C12N9/34
• 分類號: C12N9/34;C12N15/81;C12N1/19;C12P19/20;C12P19/02;C12R1/84
• 代理公司: 北京瑞盛銘杰知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11617
• 代理人: 郭曉迪

本發(fā)明提供一種糖化酶突變體及其應(yīng)用。目前工業(yè)上采用絲狀真菌微生物生產(chǎn)的糖化酶具有生產(chǎn)效率高、熱穩(wěn)定性好的優(yōu)點。但微生物發(fā)酵的糖化酶在高濃度葡萄糖存在的時具有較高的轉(zhuǎn)苷活性，影響糖化效率。本發(fā)明通過定點突變，降低了其轉(zhuǎn)苷活力，提高了其比活力。其中轉(zhuǎn)苷活力降低了16.6％?100％不等，酶比活力最高提高了約40.4％。該發(fā)明為淀粉質(zhì)原料的高效糖化及其在發(fā)酵工業(yè)中的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于基因工程和酶工程技術(shù)領(lǐng)域，具體地說涉及糖化酶突變體及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

糖化酶，又名葡萄糖淀粉酶(glucoamylase，GA，EC 3.2.1.3)，全稱為α-1，4-葡萄糖苷水解酶(α-1，4-D-glucan glucohydrolase)。它可以從可溶性淀粉、支鏈淀粉、麥芽糖、糖原等多聚糖和寡糖的非還原性末端水解α-1，4糖苷鍵，也可以緩慢水解α-1，6糖苷鍵和α-1，3糖苷鍵，依次釋放β-D-葡萄糖。

糖化酶是我國產(chǎn)量最大、應(yīng)用范圍最廣的酶制劑之一，主要應(yīng)用于淀粉加工、釀造發(fā)酵業(yè)、紡織品工業(yè)、面包工業(yè)、醫(yī)藥工業(yè)、飼料工業(yè)等行業(yè)。目前工業(yè)生產(chǎn)上生產(chǎn)糖化酶的主要生產(chǎn)菌種是絲狀真菌，其糖化酶在糖濃度較高時，具有一定的轉(zhuǎn)苷活性，在糖化過程中會將水解的葡萄糖轉(zhuǎn)化成非發(fā)酵性的低聚糖如異麥芽糖、潘糖等，不僅影響發(fā)酵時糖類的高效利用，也影響葡萄糖生產(chǎn)中最終產(chǎn)品的純度和產(chǎn)率以及葡萄糖的結(jié)晶。因此需要對糖化酶基因進行改造，降低其轉(zhuǎn)苷活性。

發(fā)明內(nèi)容

為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種絲狀真菌來源的糖化酶突變體及其應(yīng)用。

本發(fā)明中采用如下定義：

1、氨基酸殘基使用公認IUPAC命名法，用三字母縮寫或單字母符號形式。DNA核酸序列采用公認IUPAC命名法。

2、突變體的標識：采用“原始氨基酸位置替換的氨基酸”來表示糖化酶突變體中突變的氨基酸。如D259E，表示第259位的氨基酸由親本糖化酶的天冬氨酸Asp替換成谷氨酸Glu，位置的編號對應(yīng)于SEQ ID NO：1中糖化酶的氨基酸序列編號。如D259E/S413A，表示第259位和第413位的氨基酸都發(fā)生了突變。

本發(fā)明的技術(shù)方案概述如下：

本發(fā)明通過定向改造構(gòu)建的糖化酶突變體，以親本野生型糖化酶(GenBank ID:CAC28076.1)出發(fā)，利用定點突變技術(shù)，野生型糖化酶氨基酸序列SEQ ID NO:1中在氨基酸取代位置突變，得到所述糖化酶突變體如下：

第22位、第29位、第32位、第259位、第413位中至少一個氨基酸替換為二十種常見氨基酸中的一種；

優(yōu)選地，所述糖化酶突變體是氨基酸序列SEQ ID NO:1中在氨基酸取代位置突變，得到突變體如下：

第259位的天冬氨酸替換為二十種常見氨基酸中的一種，和/或第22位、第29位、第32位、第413位中至少一個氨基酸替換為二十種常見氨基酸中的一種；

更優(yōu)選地，所述糖化酶突變體書氨基酸序列SEQ ID NO:1中在氨基酸取代位置突變，得到突變體如下：

(1)第22位氨基酸天冬酰胺(N)替換為半胱氨酸(C)、第29位丙氨酸(A)替換為半胱氨酸(C)以及第259位氨基酸天冬氨酸(D)替換為谷氨酸(E)；或，

(2)第22位氨基酸天冬酰胺(N)替換為半胱氨酸(C)、第29位丙氨酸(A)替換為半胱氨酸(C)以及第32位氨基酸丙氨酸(A)替換為脯氨酸(P)；或，

(3)第259位氨基酸天冬氨酸(D)替換為谷氨酸(E)以及第413位絲氨酸(S)替換為丙氨酸(A)；或，

(4)第259位氨基酸天冬氨酸(D)替換為谷氨酸(E)；或，