[發明專利]一種復合型石墨烯包裹磷脂酶D及其制備方法和在產磷脂酰絲氨酸中的應用

在審

• 申請號: 202010120816.3
• 申請日: 2020-02-26
• 公開（公告）號: CN111304191A
• 公開（公告）日: 2020-06-19
• 發明（設計）人: 陳可泉;馮嬌;王昕
• 申請（專利權）人: 南京凱諾生物科技有限公司
• 主分類號: C12N11/14
• 分類號: C12N11/14;C12P13/06
• 代理公司: 江蘇圣典律師事務所 32237
• 代理人: 胡建華

本發明公開了一種復合型石墨烯包裹磷脂酶D及其制備方法和在產磷脂酰絲氨酸中的應用。所述的制備方法包括如下步驟：(1)將產磷脂酶D菌株，培養，離心，所得上清液即為粗酶液；(2)將粗酶液與碳酸氫鈉溶液混合后，加入石墨烯粉末，攪拌；(3)向步驟(2)所得物料中加入氯化鈣溶液，攪拌，靜止，離心，即得。與現有技術相比，本發明具有如下優勢：(1)通過摻雜低成本的碳酸鈣材料避免了單一使用石墨烯作為固定化載體的高昂成本。(2)引入碳酸鈣材料充作復合增強材料得到碳酸鈣?石墨烯包裹的磷脂酶D微顆粒，避免了石墨烯尺寸過小，導致的分離困難，對生產的技術要求高的缺點。

技術領域

本發明屬于磷脂酰絲氨酸生產技術領域，具體涉及一種復合型石墨烯包裹磷脂酶D及其制備方法和在產磷脂酰絲氨酸中的應用。

背景技術

磷脂酶D可以通過磷脂酰基轉移作用催化磷脂質的極性頭部基團的轉移，廣泛用于磷脂酰絲氨酸等脂類化合物的合成。能夠產磷脂酶D的微生物很多，已報道的包括鏈霉菌、大腸桿菌、芽孢桿菌等。由于微生物制備磷脂酶D具有單位活性高，生物催化成本低廉，方法簡單易行等優勢，故磷脂酶D的制備主要集中在微生物來源。因為磷脂酶D的反應體系相對比較復雜，對磷脂酶D活性產生影響的因素有很多，除了溫度、pH等反應環境因素外，還有金屬離子、底物濃度比、溶劑、反應體系等因素。原因包括：酶是一種可溶的催化劑；酶通常不穩定；酶可能會受到底物與產物的抑制作用；酶通常作用于天然底物并且在一些生理條件下進行催化作用。因此通過反應過程控制與生物反應器設計來提高酶的性能是一種簡便且可行性高的操作手段。

石墨烯作為一種應用廣泛的納米材料，具有獨特而優良的物化性能，是固定酶的理想載體。單一的石墨烯作為固定化酶載體往往性能受限，例如：尺寸較小分離困難，因為僅僅依靠靜電吸附作用力導致的酶易脫落等缺陷，通過摻雜其他固定化材料優化材料石墨烯的使用性能是目前構建復合型石墨烯固定化酶載體的重點。本發明利用材料復合技術利用其他材料對石墨烯固定化酶手段進行降低成本、提高使用效率的，其次利用復合材料對于磷脂酶D的優化包裹，制備得到耐受性和催化活性提升的磷脂酶D酶制劑，進而利用在磷脂酰絲氨酸的生產應用上。

發明內容

發明目的：本發明所要解決的技術問題是針對現有技術中磷脂酶D的穩定性差導致的催化效果差，提供一種復合型石墨烯包裹磷脂酶D。

發明思路：利用微生物細胞表達磷脂酶D蛋白后，對所需的磷脂酶D蛋白進行提取。利用石墨烯對于酶蛋白的靜電吸附作用進行吸附的同時，引入碳酸鈣(氯化鈣和碳酸氫鈉反應生成碳酸鈣)材料充作復合增強材料，優化摻雜過程和條件后，得到復合型墨烯包裹的磷脂酶D微顆粒。

本發明還要解決的技術問題是提供上述復合型石墨烯包裹磷脂酶D的制備方法。

本發明最后要解決的技術問題是提供上述復合型石墨烯包裹磷脂酶D在產磷脂酰絲氨酸中的應用，該方法對于磷脂酰絲氨酸的產量有了明顯的提升，避免單一使用石墨烯作為固定化載體的高昂成本，降低了磷脂酶D酶制劑的生產成本，并且提升了磷脂酶D酶制劑的使用性能。

為了解決上述技術問題，本發明公開了一種復合型石墨烯包裹磷脂酶D的制備方法，其包括如下步驟：

(1)將產磷脂酶D菌株，培養，離心，所得上清液即為粗酶液；

(2)將步驟(1)得到的粗酶液與碳酸氫鈉溶液混合后，加入石墨烯粉末，攪拌；

(3)向步驟(2)所得物料中加入氯化鈣溶液，攪拌，靜止，離心，即得。

步驟(1)中，所述的產磷脂酶D的菌株的構建方法為從NCBI查到的鏈霉菌Streptomyces PMF的磷脂酶D基因序列(磷脂酶D基因簡稱為PMF)，由于該序列來源于鏈霉菌，以帶有OmpA信號肽的pET-28a質粒為載體，在大腸桿菌E.coli BL21(DE3)中的進行外源表達，即為重組大腸桿菌，將其涂布制備菌落平板。其中，PMF的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。