[發明專利]一種體外檢測rhTSG-6抗病毒活性的方法及rhTSG-6在抗病毒藥物中的應用

有效

• 申請號: 202010116350.X
• 申請日: 2020-02-25
• 公開（公告）號: CN111172326B
• 公開（公告）日: 2020-11-10
• 發明（設計）人: 王明麗;吳博;夏兵兵;何志遠;周煒;蔣敏之
• 申請（專利權）人: 蕪湖天明生物技術有限公司
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/02;A61K38/17;A61P31/14
• 代理公司: 蕪湖安匯知識產權代理有限公司 34107
• 代理人: 尹婷婷

本發明公開了一種體外檢測rhTSG?6抗病毒活性的方法及rhTSG?6在抗病毒藥物中的應用。采用牛腎上皮細胞(MDBK)，但不限于僅用此種細胞作為測定細胞，水皰性口炎病毒(VSV)，但不限于僅用此種病毒作為攻擊病毒以檢測rhTSG?6的抗病毒活性，本發明方法用于檢測rhTSG?6抗病毒活性時，能準確客觀地顯示出TSG?6的抗病毒活性的有無及效價，有效地解決了對rhTSG?6抗病毒活性的觀察及評價難題。該方法具有操作相對簡便、結果明確易判斷等特征。

技術領域

本發明屬于病毒學與生物技術領域，具體涉及一種體外檢測rhTSG-6抗病毒活性的方法及rhTSG-6在抗病毒藥物中的應用。

背景技術

腫瘤壞死因子α刺激基因6(tumor necrosis factor-α stimulated gene 6，TSG-6)是一種炎癥相關的分泌性蛋白，是由間充質干細胞或基質細胞(MSCs)對炎癥信號的反應產生的，在多種炎癥性疾病或類炎癥性病理過程中呈高表達。現已知，TSG-6介導了許多免疫調節和組織修復過程，具有抗炎和組織保護作用，是一個正調節的功能蛋白。大量研究表明，TSG-6具有抑制炎癥因子TNF-α、IL-1β和IL-6等的表達，抑制中性粒細胞浸潤等功能，發揮較強的抗炎作用。隨著相關研究進展，TSG-6的抑炎功能逐漸受到生物醫藥領域的日益重視。本發明首次發現，重組人TSG-6(recombinant human TSG-6，rhTSG-6)在體內外均具有抗病毒活性。

發明內容

本發明提供了一種體外檢測rhTSG-6抗病毒活性的方法及rhTSG-6在抗病毒藥物中的應用。本方法及其應用基于rhTSG-6能夠保護MDBK細胞，但不限于此種細胞免受VSV病毒，但不限于此種病毒侵害作用的現象作為檢測結果體系。本方法能準確客觀地觀察與檢測rhTSG-6抗病毒活性，重復性及準確度均高。經本方法驗證，rhTSG-6抗VSV病毒的效價高達1000.00U/mL。

本發明提供的檢測rhTSG-6抗病毒活性的方法以rhTSG-6抑制病毒致細胞病變效應(cytopathic effect,CPE)現象作為檢測其活性的結果，即以每毫升rhTSG-6檢品的最高稀釋度仍能保護半數細胞(50％)免受病毒的攻擊的稀釋度的倒數定為rhTSG-6單位(或稱效價)，常以單位(U)表示。該結果經用結晶紫對存活的MDBK細胞染色觀察后，根據著色深淺，按Reed-Muench公式計算出所測rhTSG-6的抗病毒活性。

本發明采取的技術方案為：

一種檢測重組人腫瘤壞死因子α誘導蛋白6抗病毒活性的方法，以牛腎上皮細胞(MDBK細胞)作為測定細胞，水皰性口炎病毒(VSV)作為攻擊病毒來檢測rhTSG-6的抗病毒活性。

進一步地，所述MDBK細胞還可替換為ST、PK-15、Vero、Hela和HF細胞等，即本方法也不局限于用MDBK細胞或ST細胞進行活性檢測，也可選用其他細胞進行檢測。所述VSV病毒還可替換為TGEV、PEDV、HCMV、HSV、VZV、RSV及流感病毒和禽流感病毒等。即本方法也不局限于用VSV病毒進行活性檢測，也可選用其他病毒進行檢測。

所述檢測重組人腫瘤壞死因子α誘導蛋白6抗病毒活性的方法，具體包括以下步驟：

(1)將rhTSG-6經稀釋液依次進行二倍遞增梯度稀釋，共做10個稀釋梯度，稀釋后的rhTSG-6依次加入相應96孔細胞板中；

(2)將MDBK單層細胞懸液做相應稀釋，然后加入含rhTSG-6的細胞板孔中，培養長至均勻的單層細胞，并設置細胞對照組和病毒對照組；

(3)棄上清，向每孔中加入VSV病毒液，細胞對照孔加維持液，進行培養；

(4)觀察并統計各稀釋梯度CPE孔數和無CPE孔數，根據Reed-Muench法計算rhTSG-6的效價。