[發(fā)明專利]生物合成石竹烯的聚球藻基因工程菌及其構(gòu)建方法與應(yīng)用有效
| 申請(qǐng)?zhí)枺?/td> | 202010107036.5 | 申請(qǐng)日： | 2020-02-21 |
| 公開（公告）號(hào)： | CN111394383B | 公開（公告）日： | 2022-10-04 |
| 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人： | 陳磊;李樹斌;孫韜;張衛(wèi)文 | 申請(qǐng)（專利權(quán)）人： | 天津大學(xué) |
| 主分類號(hào)： | C12N15/74 | 分類號(hào)： | C12N15/74;C12N15/65;C12N15/61;C12N15/54;C12N1/21;C12P5/00 |
| 代理公司： | 天津市北洋有限責(zé)任專利代理事務(wù)所 12201 | 代理人： | 陸藝 |
| 地址： | 300350 天津市津南區(qū)海*** | 國(guó)省代碼： | 天津;12 |
| 權(quán)利要求書： | 查看更多 | 說明書： | 查看更多 |
| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 生物 合成 石竹 聚球藻 基因工程 及其 構(gòu)建 方法 應(yīng)用 | ||
1.生物合成石竹烯的聚球藻基因工程菌的構(gòu)建方法，其特征是包括如下步驟：
(1)分別構(gòu)建基礎(chǔ)載體pSI-SPE、pSII-CM和pSIII-KAN：
按照pBR322質(zhì)粒骨架、中性位點(diǎn)NSI上游同源臂基因、壯觀霉素抗性基因speR、啟動(dòng)子PCPC560、終止子Trbcl、中性位點(diǎn)NSI下游同源臂基因的順序組裝成載體pSI-SPE；
按照pBR322質(zhì)粒骨架、中性位點(diǎn)NSII上游同源臂基因、氯霉素抗性基因cmR,、啟動(dòng)子PCPC560、終止子Trbcl、中性位點(diǎn)NSII下游同源臂基因的順序組裝成載體pSII-CM；
按照pBR322質(zhì)粒骨架、中性位點(diǎn)NSIII上游同源臂基因、卡那霉素抗性基因kanR、啟動(dòng)子PCPC560、終止子Trbcl、中性位點(diǎn)NSIII下游同源臂基因的順序組裝成載體pSIII-KAN；
pBR322基本骨架如SEQ ID NO.56所示；
所述中性位點(diǎn)NSI上游同源臂基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；
所述壯觀霉素抗性基因speR的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示,
所述啟動(dòng)子PCPC560的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
所述終止子Trbcl的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
所述中性位點(diǎn)NSI下游同源臂基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；
所述中性位點(diǎn)NSII上游同源臂基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；
所述氯霉素抗性cmR的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示；
所述中性位點(diǎn)NSII下游同源臂基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；
所述中性位點(diǎn)NSIII上游同源臂基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；
所述卡那霉素抗性基因kanR的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示；
所述中性位點(diǎn)NSIII下游同源臂基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；
(2)用啟動(dòng)子Ppsba1替換pSI-SPE中的啟動(dòng)子PCPC560，在啟動(dòng)子Ppsba1終止子Trbcl之間按順序插入牻牛兒基焦磷酸/法尼基焦磷酸合酶基因ispA、藍(lán)細(xì)菌用高強(qiáng)度核糖體結(jié)合位點(diǎn)序列RBS、經(jīng)密碼子優(yōu)化的牻牛兒基焦磷酸合酶基因gpps、啟動(dòng)子Ptrc和異戊烯基二磷酸δ-異構(gòu)酶基因idi1，構(gòu)建載體pSI-ispA-gpps-idi1sc；
所述啟動(dòng)子Ppsba1的核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示；
所述牻牛兒基焦磷酸/法尼基焦磷酸合酶基因ispA的核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示；
所述藍(lán)細(xì)菌用高強(qiáng)度核糖體結(jié)合位點(diǎn)序列RBS的核苷酸序列如SEQ ID NO.55所示；所述經(jīng)密碼子優(yōu)化的牻牛兒基焦磷酸合酶基因gpps的核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示，所述基因gpps是根據(jù)北美冷杉Abies grandis中GPPS2氨基酸序列對(duì)于聚球藻UTEX 2973密碼子優(yōu)化后得到的；
所述啟動(dòng)子Ptrc的核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示；
所述異戊烯基二磷酸δ-異構(gòu)酶基因idi1核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示；
(3)在pSII-CM的啟動(dòng)子PCPC560與終止子Trbcl之間插入異戊烯基二磷酸δ-異構(gòu)酶基因idi1，構(gòu)建載體pSII-idi1sc；
所述異戊烯基二磷酸δ-異構(gòu)酶基因idi1核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示；
(4)用啟動(dòng)子Ppsba3替換pSIII-KAN中的啟動(dòng)子PCPC560，在啟動(dòng)子Ppsba3與終止子Trbcl之間插入經(jīng)密碼子優(yōu)化的石竹烯合酶基因tps21，構(gòu)建載體pSIII-tps21；
所述啟動(dòng)子Ppsba3核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示；
所述石竹烯合酶基因tps21的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示，所述基因tps21為根據(jù)擬南芥Arabidopsis thaliana中TPS21氨基酸序列對(duì)于聚球藻UTEX 2973密碼子優(yōu)化后得到的，
(5)將所述質(zhì)粒pSI-ispA-gpps-idi1sc，pSIII-tps21以及pSII-idi1sc轉(zhuǎn)入聚球藻UTEX2973獲得基因工程菌。
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