[發明專利]一種檢測三七銹腐病菌的LAMP引物組及檢測方法

有效

• 申請號: 202010106050.3
• 申請日: 2020-02-21
• 公開（公告）號: CN111057788B
• 公開（公告）日: 2022-10-14
• 發明（設計）人: 蘭成忠;林雄;代玉立;姚鳳鑾
• 申請（專利權）人: 福建省農業科學院植物保護研究所
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12Q1/6844;C12Q1/04;C12N15/11;C12R1/645
• 代理公司: 福州元創專利商標代理有限公司 35100
• 代理人: 饒文君;蔡學俊

本發明提供了一種三七銹腐病菌的LAMP檢測引物及檢測方法，以三七銹腐病菌β?tubulin基因為檢測靶標，設計了4條LAMP特異性引物，分別為：F3、B3、FIP和BIP；序列如SEQ ID NO.1?4所示。本發明解決了現有技術檢測周期長、靈敏度不高、特異性不強、操作復雜、儀器設備要求高等缺陷，提供了一種特異性強、靈敏度高、操作簡便、對環境設備要求不高、低成本的LAMP快速準確檢測技術，特別適合三七銹腐病田間樣品快速檢測，為三七銹腐病的診斷與防控提供了一種方法。

技術領域

本發明屬于農作物病害檢測、鑒定及防治技術領域，具體涉及一種檢測三七銹腐病菌的LAMP引物組及檢測方法，可用于三七銹腐病菌快速、靈敏和特異的分子檢測，同時可用于三七銹腐病的早期診斷和病菌的監測和鑒定。

背景技術

三七【Panax notoginseng (Burk.) F H Chen】又稱田七、金不換，譽有“南國神草”稱號，是一種五加科（Araliaceae）人參屬多年生宿根名貴中藥材，具有活血、化淤、消腫定痛、抗炎癥、抗氧化和抗衰老等功效。三七經過數百年的人工馴化種植，現已形成大面積種植于云南和廣西等省份（區）。由于長期大規模、單一、連片種植，加之三七喜冬暖夏涼、半陰和潮濕的生態環境，不耐嚴寒與醋熱，因其生長環境的特殊性，常導致三七各種病害的發生和流行。研究表明，三七地下及莖基部的主要病害有立枯病、猝倒病、疫病、根腐病等。其中由毀滅柱孢菌（Cylindrocarpon destructans）引起的銹腐病是三七根腐病中發病率和危害最大的一種，常年發病率在20%-30%之間，嚴重時高達70%。三七地下部分病害既不能為人們預先發現，也難以控制，只有發現葉片變色時才能得以發現，因而三七地下部分病害成為了當前三七最嚴重的病害，也是影響三七產業化健康可持續發展的重要難題。所以，開展三七銹腐病的預防與防控對于三七生產具有十分重要的意義。

病原菌的準確鑒定與檢測是病害有效防控的前期基礎，病原菌傳統的鑒定和檢測主要依賴常規的形態學并結合傳統的鑒別寄主方法，流程通常如下：從發病組織中分離或直接獲得病原菌、采用形態學特征對病原菌進行初步鑒定、將獲得的病原菌接回到原來寄主植物上、待寄主發病后，再次從接種寄主發病組織上分離病原菌，若分離到與最初的病原菌一致，則可確定為致病菌。這種運用形態學方法進行鑒定不僅耗時費力，而且需要具備專業的分類學知識及豐富的經驗，不能滿足病害快速、準確鑒定、診斷的需求。隨著分子生物學技術的發展，常規PCR、巢式PCR和實時熒光定量PCR等DNA體外PCR擴增技術成功地應用于植物病原菌的準確鑒定和快速檢測中。PCR技術雖然提升了病原菌鑒定的準確性和檢測的快速性，但仍存在需要依賴精密的PCR儀、凝膠成像系統等貴重儀器設備、操作繁瑣和操作人員需具備一定分子生物學技術等問題，使得該技術在經濟欠發達地區和基層農業部門的使用、推廣受到很大的限制。因此，很有必要建立新的檢測技術以期實現對三七銹腐病菌快速、簡便檢測。

環介導等溫擴增（Loop-mediated Isothermal Amplification，LAMP）技術是日本榮研公司開發的一種簡便、快速、準確及廉價的核酸高效擴增技術，該技術可在60℃~65℃恒溫條件下，利用高活性的鏈置換DNA聚合酶 (Bst DNA polymerase) 對目的DNA片段進行特異性擴增，在1小時內即可觀察結果。LAMP技術具特異性強、設備要求低、操作簡單、靈敏度高、反應時間短等優點被廣泛應用于多種病原菌檢測中。截至目前為止，尚未見有LAMP技術用于檢測三七銹腐病菌的相關技術報道。

發明內容

本發明的目的在于克服現有技術中對三七銹腐病菌檢測和鑒定主要基于形態學特征耗時長、程序繁瑣、經驗性強、準確度低，難以做到對病害發生的及時監測和控制病原菌的傳播、流行，以及現有PCR分子檢測需要依靠擴增儀等貴重儀器，且檢測時間較長等問題，提供一組用于檢測三七銹腐病菌的LAMP引物，以及特異性強、靈敏度高、易于操作和結果可靠的LAMP檢測方法。

為實現本發明的目的，采用以下技術方案，包括下列步驟：