[發明專利]基于金屬標記的阿爾茲海默癥腦組織Aβ蛋白的原位檢測方法

有效

• 申請號: 202010105730.3
• 申請日: 2020-02-20
• 公開（公告）號: CN111393524B
• 公開（公告）日: 2022-04-08
• 發明（設計）人: 高雪;羅施中;馮流星
• 申請（專利權）人: 北京化工大學;中國計量科學研究院
• 主分類號: C07K16/18
• 分類號: C07K16/18;G01N33/532;G01N33/68
• 代理公司: 北京知元同創知識產權代理事務所(普通合伙) 11535
• 代理人: 牛艷玲

本發明公開了一種基于金屬標記技術的腦組織切片上Aβ蛋白的成像技術。雙(2,2'?聯吡啶)?4'?甲基?4?羧基聯吡啶?釕N?琥珀酰亞胺酯?雙?(六氟磷酸鹽)(以下簡稱Ru?NHS酯)和Aβ抗體耦聯形成金屬螯合物，通過免疫反應，使金屬間接標記在腦組織中的Aβ上。通過激光剝蝕電感耦合等離子體質譜檢測大腦上的Ru的信號強度，最終繪制腦組織切片上Aβ的分布圖。本方法條件溫和，最大程度的保留了腦組織切片的原貌，使Aβ蛋白的分布位置及聚集程度完整精確的展現，具有精確性和溯源性。

技術領域

本發明屬于分析化學領域，特別涉及蛋白原位分析方法的開發與應用。

背景技術

阿爾茲海默癥(Alzheimer disease，AD)是一種神經退行性疾病，其主要癥狀有記憶力減退和認知行為困難，對患者造成極大痛苦。腦內蛋白的異常一般早于癥狀的出現。因此，對于阿爾茲海默癥的病理研究有助于病情的發現與治療。β-淀粉樣蛋白(amyloidβ-protein，Aβ蛋白)級聯假說是公認的阿爾茲海默癥的發病機理，即過量的Aβ蛋白在腦內沉積形成淀粉樣斑塊引發神經系統的退行性改變。

目前，針對Aβ蛋白的研究樣品主要來源于腦脊液和血漿。腦脊液中Aβ水平的改變并不具有特異性；血漿樣品來源于外周組織，無法對AD的病理有直觀的體現。研究腦內Aβ蛋白沉積情況對于阿爾茲海默癥的病理研究及藥物篩選等至關重要。

成像技術使腦內蛋白水平變化可視化，提供了病理變化的時間空間信息。臨床上AD的分期主要通過計算機斷層掃描(CT)、放射性標記共振成像(MRI)來實現，但這些技術不足以呈現AD早期斑塊的形成。通過正電子發射斷層掃描(PET)可以檢測微小斑塊，但存在放射性標記的潛在危險。傳統的免疫組化染色與免疫熒光檢測也可對腦內的Aβ進行成像研究，但存在操作復雜、影響因素多等缺陷。特別是，以上成像手段都無法對腦內的Aβ進行原位定量分析。

總之，現有技術仍然缺乏快速、準確、直觀的確定Aβ蛋白在腦內沉積情況的方法，從而缺乏有效的篩選阿爾茨海默病治療藥物的方法。

發明內容

本發明提供了一種基于金屬標記技術的免疫質譜成像方法，具體來說，雙(2,2'-聯吡啶)-4'-甲基-4-羧基聯吡啶-釕N-琥珀酰亞胺酯-雙-(六氟磷酸鹽)(以下簡稱Ru-NHS酯)和Aβ抗體耦聯形成螯合物后，經過免疫反應，使Ru間接標記在腦組織中的Aβ蛋白上，然后通過激光剝蝕電感耦合等離子體質譜(LA-ICP-MS)檢測腦組織切片上的Ru的信號強度，繪制腦組織切片上以及進一步繪制腦組織中Aβ蛋白的分布圖，從而在不破壞腦組織的完整性的前提下，實現了Aβ蛋白的原位成像，能夠完整、精確地展現腦組織中Aβ蛋白的分布位置及聚集程度，并具有溯源性，從而有利于對阿爾茲海默癥的發明機理進行研究。另外，本發明還可實現對腦組織中Aβ蛋白的定量檢測。本發明的方法操作簡單，特異性和靈敏度高，穩定性好，重復性強。

根據本發明的一個方面，本發明提供一種螯合物，由雙(2,2'-聯吡啶)-4'-甲基-4-羧基聯吡啶-釕N-琥珀酰亞胺酯-雙-(六氟磷酸鹽)(Ru-NHS酯)和Aβ抗體耦聯形成。本領域技術人員可以理解，Ru-NHS酯將Aβ抗體氨基酸側鏈氨酰化形成本發明的螯合物。優選地，螯合物中Ru-NHS酯和Aβ抗體的摩爾比為50:1-500:1，更優選為約500:1。

本領域可以理解，各種能夠與Aβ蛋白結合的Aβ抗體均可用于本發明。優選地，所述抗體來自于哺乳動物，優選人、小鼠、兔、山羊等；所述抗體能夠與哺乳動物，優選人、小鼠、兔、山羊等Aβ蛋白結合；所述抗體能夠與β淀粉樣前體蛋白(β-amyloid precursorprotein，APP)、Aβ1-40、Aβ1-42中的一種或多種結合，優選Aβ1-42；所述Aβ抗體為單克隆抗體。本領域技術人員可以理解，Aβ抗體可以商購獲得或者通過本領域已知的方法制備得到。

根據本發明的另一個方面，本發明提供上述螯合物的制備方法，該方法包括將Ru-NHS酯和Aβ抗體反應的步驟。優選地，該方法包括以下步驟：