[發(fā)明專利]一種用熒光SSR分子標記構建蘋果新品種‘赤霞’分子身份證的方法及應用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202010104838.0
• 申請日: 2020-02-20
• 公開（公告）號: CN111218522A
• 公開（公告）日: 2020-06-02
• 發(fā)明（設計）人: 侯麗媛;曹秋芬;張春芬;鄧舒;肖蓉;董艷輝;趙菁
• 申請（專利權）人: 山西省農(nóng)業(yè)科學院生物技術研究中心
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12Q1/6869;C12N15/11;G16B20/20
• 代理公司: 太原晉科知識產(chǎn)權代理事務所(特殊普通合伙) 14110
• 代理人: 翟沖燕

1.一種用熒光SSR分子標記構建蘋果栽培新品種‘赤霞’分子身份證的熒光SSR分子標記，其特征在于：所述熒光標記為6-FAM^TM熒光標記，將SSR分子的正向引物5'端分別用6-FAM^TM熒光標記進行分子標記，所述SSR分子為7對熒光SSR標記，具體分別為：熒光SSR分子標記G142，熒光SSR分子標記G147，熒光SSR分子標記G162，熒光SSR分子標記01f02，熒光SSR分子標記01h01，熒光SSR分子標記02d08，熒光SSR分子標記SSR標記02d12；用于擴增上述標記的引物分別為：

熒光SSR分子標記G142核苷酸序列如SEQ ID No.1、2所示；

熒光SSR分子標記G147核苷酸序列如SEQ ID No.3、4所示；

熒光SSR分子標記G162核苷酸序列如SEQ ID No.5、6所示；

熒光SSR分子標記01f02核苷酸序列如SEQ ID No.7、8所示；

熒光SSR分子標記01h01核苷酸序列如SEQ ID No.9、10所示；

熒光SSR分子標記02d08核苷酸序列如SEQ ID No.11、12所示；

熒光SSR分子標記02d12核苷酸序列如SEQ ID No.13、14所示。

2.利用權利要求1所述的熒光SSR分子標記構建蘋果栽培新品種‘赤霞’分子身份證的方法，其特征在于：具體方法為：以蘋果栽培新品種‘赤霞’基因組DNA為PCR擴增模板，分別以所述熒光SSR分子標記為引物對，進行PCR擴增，PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)過純化后，基因測序儀上進行熒光檢測，并收集原始數(shù)據(jù)；GeneMapper3.0軟件分析原始數(shù)據(jù)，獲得不同樣品擴增片段的長度即供試材料指紋圖譜數(shù)據(jù)；PopGen32分析供試材料指紋圖譜數(shù)據(jù)，獲得引物多態(tài)性，將每對引物獲得的等位基因按照從小到大的順序排列，并用阿拉伯數(shù)字從01開始賦值，將每份材料在7個位點的等位基因按照賦值數(shù)字編碼得到每份供試材料獨有的字符串；再利用條碼技術將每份材料按相同位點順序排列的編碼字符串轉化成每份材料獨特的條碼標識即分子身份證。

3.根據(jù)權利要求2所述利用熒光SSR分子標記構建蘋果栽培新品種‘赤霞’分子身份證的方法，其特征在于：PCR擴增反應體系為10 μL，其中，2μmol?L^-1 F-primer 1.0μL，2μmol?L^-1 R-primer 1.0 μL，25 mmol?L^-1 dNTP 0.08μL，不含Mg²⁺的10×PCR buffer 1.0μL，25mmol?L^-1 Mg²⁺ 0.6μL，5U?μL^-1 Taq酶0.08μL，模板DNA（20 ng?μL^-1）2 μL，ddH₂O 4.24 μL；

PCR擴增程序：94 ℃預變性5 min；94℃變性1 min，退火1min， 72 ℃延伸2min，32個循環(huán)；72℃保持10 min；4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

4.根據(jù)權利要求2所述利用熒光SSR分子標記構建蘋果栽培新品種‘赤霞’分子身份證的方法，其特征在于：擴增產(chǎn)物的純化具體為：（1）根據(jù)擴增產(chǎn)物分子量大小混合純化PCR產(chǎn)物；在6μL無水乙醇中加入2μL PCR產(chǎn)物，輕輕震蕩2~3 min，混勻，3000 r?min^-1離心30 min；（2）小心倒出液體，倒置離心管片刻后，700 r?min^-1離心30~ 60 s，甩干液體；（3）加入60 μL70%乙醇，輕輕震蕩2~3 min，混勻，3000 r?min^-1離心10 min；（4）小心倒出液體，倒置離心管片刻后，700 r?min^-1 離心30~60 s，靜置5 min；（5）加入60 μL ddH₂O，震蕩混勻，室溫避光溶解1 h，4℃保存待備用。