[發(fā)明專利]豬病毒性腹瀉病病原的四重TaqMan熒光定量PCR檢測方法

在審

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• 申請日: 2020-02-20
• 公開（公告）號: CN111235310A
• 公開（公告）日: 2020-06-05
• 發(fā)明（設計）人: 粟碩;潘中洲;陸佳萱;張騁;趙雯;何婉婷;王茹怡;翟曉鳳
• 申請（專利權）人: 南京農業(yè)大學
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/6851;C12N15/11;C12R1/93
• 代理公司: 南京經緯專利商標代理有限公司 32200
• 代理人: 黃欣

本發(fā)明公開了一種豬病毒性腹瀉病病原的四重Taqman熒光定量PCR檢測方法（熒光定量聚合酶鏈式反應，qPCR，又稱real?time PCR）。具體地，針對豬德爾塔冠狀病毒、豬凸隆病毒、豬流行性腹瀉病毒和豬急性腹瀉綜合征冠狀病毒，設計了四對特異性引物和TaqMan探針，實現了在一個PCR反應管中同時檢測四種能夠引起豬群腹瀉的病毒，且其檢測靈敏度達到初始模板濃度為每微升1×10²個拷貝（1×10² copies·μL^?1），并具有極佳的特異性和重復性，可以直接應用到臨床樣品檢測中。

技術領域

本發(fā)明屬于病原體檢測技術領域，尤其涉及一種豬病毒性腹瀉病病原的四重TaqMan探針法qPCR檢測技術。

背景技術

豬病毒性腹瀉是造成我國養(yǎng)豬業(yè)經濟損失的一個重要原因。造成豬病毒性腹瀉的病原種類多樣，并時常伴有混合感染，給相關檢測、診斷、防治工作帶來了很大困擾。為了更好地監(jiān)測和控制豬病毒性腹瀉，對于豬群中包括豬德爾塔冠狀病毒(PorcineDeltacoronavirus，PDCoV)、豬凸隆病毒(Porcine Torovirus，PToV)、豬流行性腹瀉病毒(Porcine Epidemic Diarrhea Virus，PEDV)、豬急性腹瀉綜合征冠狀病毒(Swine AcuteDiarrhea Syndrome Coronavirus,SADS-CoV)在內的多種高致病性、高傳染性的豬病毒性腹瀉病病原的檢測顯得十分必要。因此，針對豬病毒性腹瀉病病原建立一種簡便、快速、高效、經濟的檢測方法是獸醫(yī)臨床實踐中亟需解決的問題。

四重qPCR檢測技術可以最多同時檢測出四種豬病毒性腹瀉病病原，相比于普通PCR具有靈敏度高、精確度好、無需電泳便可直接分析結果等優(yōu)點，極大地縮短了檢測過程中的物料成本和檢測人員的時間成本，尤其適用于大規(guī)模的樣品檢測和樣品的混合感染檢測。但是，由于四重qPCR在一個體系中同時存在多對引物及探針，為了保證其有效進行，各引物對和探針之間就必須要保持高度的特異性以避免出現非特異性的擴增產物和熒光信號，并且還必須要保持相對一致的擴增效率便于對模板量進行測算。另外，模板中更為復雜的核酸環(huán)境，不同引物對所要求的不同的退火溫度也都是制約多重qPCR檢測方法建立的主要因素。qPCR相較于傳統(tǒng)PCR具有極高的靈敏度，而且能夠允許多個通道同時檢測多種不同的病原，使得建立多重qPCR檢測方法更有意義。所以，建立一種四重TaqMan探針法qPCR檢測方法雖然實現起來頗具難度，但具有很高的臨床生產價值。

發(fā)明內容

解決的技術問題：為了解決多重PCR技術在應用于豬群的病毒性腹瀉疾病診斷中效果不佳等技術問題，本發(fā)明提出了一種豬病毒性腹瀉病病原的四重TaqMan探針法qPCR檢測方法。

技術方案：豬病毒性腹瀉病病原的四重Taqman熒光定量PCR檢測方法，包括以下步驟：

步驟1，設計四種病毒的特異性qPCR檢測引物對序列及TaqMan探針序列：

用于檢測豬德爾塔冠狀病毒(Porcine Deltacoronavirus,PDCoV)的引物對序列及TaqMan探針序列：

上游引物PD-Detection(F)：5’-AAAGCTTTCAAGACAATACCT-3’(SEQ ID NO.1)

下游引物PD-Detection(R)：5’-TACGACAAACTCCTGAAAGCA-3’(SEQ ID NO.2)

TaqMan探針PD-Probe：5’-Texas Red-TACGATACGACTGCATTGGCCTAC-BHQ2-3’(SEQID NO.3)

用于檢測豬凸隆病毒(Porcine Torovirus,PToV)的引物對序列及TaqMan探針序列：