[發(fā)明專利]一種利用CRISPR-Cas9條件性敲除肝臟HO-1基因動物模型的構(gòu)建方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202010091989.7
• 申請日: 2020-02-14
• 公開（公告）號: CN111206054B
• 公開（公告）日: 2022-12-30
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 南月敏;杜靜華;王榮琦;李冬冬;苑喜微
• 申請（專利權(quán)）人: 河北醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院
• 主分類號: C12N15/90
• 分類號: C12N15/90;C12N15/53;A01K67/027
• 代理公司: 北京勁創(chuàng)知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11589
• 代理人: 張鐵蘭

本發(fā)明提供了一種利用CRISPR?Cas9條件性敲除肝臟HO?1基因動物模型的構(gòu)建方法，屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，包括以下步驟：1)將sgRNA序列、Cas9基因序列和donor基因序列導(dǎo)入小鼠的受精卵中，得到含有打靶序列的F0代小鼠；2)將所述步驟1)得到的含有打靶序列的F0代小鼠與野生型小鼠雜交，得到含有打靶序列的雜合性小鼠；3)將所述步驟2)得到的含有打靶序列的雜合性小鼠與Alb?Cre陽性小鼠雜交，得到敲除肝臟HO?1基因動物模型。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種利用CRISPR-Cas9條件性敲除HO-1基因動物模型的構(gòu)建方法。

背景技術(shù)

血紅素氧合酶-1(heme oxygenase-1，HO-1，Hmox1)是血紅素代謝的起始酶和限速酶，主要功能是催化血紅素產(chǎn)生膽紅素、一氧化碳和游離鐵，減輕血紅素對細(xì)胞膜的直接損傷及其產(chǎn)生的氧自由基導(dǎo)致的細(xì)胞損傷。目前研究表明，HO-1表達(dá)增加為機(jī)體對抗氧化應(yīng)激和脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的一種保護(hù)機(jī)制，在氧中毒、脂多糖、缺血再灌注等多種肝損傷中發(fā)揮保護(hù)肝細(xì)胞、抗炎和抗纖維化作用。HO-1缺陷小鼠應(yīng)激能力下降，可導(dǎo)致肝細(xì)胞發(fā)生炎癥、壞死。采用膽堿蛋氨酸缺乏(methionine-choline deficient，MCD)飲食分別喂養(yǎng)C57BL/6J小鼠4周、8周誘導(dǎo)非酒精性脂肪性肝炎/肝纖維化模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)模型組小鼠肝組織中HO-1表達(dá)明顯上調(diào)，表明在非酒精性脂肪性肝炎/肝纖維化中存在HO-1的激活，其表達(dá)和肝細(xì)胞的炎性壞死、纖維增生及細(xì)胞凋亡等密切相關(guān)。進(jìn)一步應(yīng)用HO-1化學(xué)誘導(dǎo)劑血晶素、腺病毒Ad-HO-1及HO-1抑制劑鋅原卟啉調(diào)節(jié)HO-1表達(dá)，結(jié)果表明內(nèi)源性升高的HO-1和外源性誘導(dǎo)HO-1可抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)，下調(diào)促炎、促纖維化相關(guān)基因表達(dá)，減緩肝臟炎癥及纖維化進(jìn)展。但是現(xiàn)有技術(shù)中還未有關(guān)于肝臟條件性敲除肝臟HO-1基因動物模型的報道。

發(fā)明內(nèi)容

有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種利用CRISPR-Cas9條件性敲除肝臟HO-1基因動物模型的構(gòu)建方法，采用本發(fā)明提供的方法能夠得到敲除HO-1基因動物模型。

為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供了以下技術(shù)方案和構(gòu)建模型的特點(diǎn)：

本發(fā)明提供了一種利用CRISPR-Cas條件性敲除肝臟HO-1基因動物模型的構(gòu)建方法，包括以下步驟：

1)將sgRNA序列、Cas9基因序列和donor基因序列導(dǎo)入小鼠的受精卵中，得到含有打靶序列的F0代小鼠；

2)將所述步驟1)得到的含有打靶序列的F0代小鼠與野生型小鼠雜交，得到含有打靶序列的雜合性小鼠；

3)將所述步驟2)得到的含有打靶序列的雜合性小鼠與Alb-Cre陽性小鼠雜交，得到敲除HO-1基因動物模型。

優(yōu)選的，所述小鼠包括C57BL/6J小鼠。

本發(fā)明提供了一種利用CRISPR-Cas9條件性敲除肝臟HO-1基因動物模型的構(gòu)建方法，包括以下步驟：1)將sgRNA序列、Cas9基因序列和donor基因序列導(dǎo)入小鼠的受精卵中，得到含有打靶序列的F0代小鼠；2)將所述步驟1)得到的含有打靶序列的F0代小鼠與野生型小鼠雜交，得到含有打靶序列的雜合性小鼠；3)將所述步驟2)得到的含有打靶序列的雜合性小鼠與Alb-Cre陽性小鼠雜交，得到敲除肝臟HO-1基因動物模型。

附圖說明

圖1為設(shè)計Hmox1條件性基因敲除小鼠策略圖；

圖2為中靶序列：綠色為外顯子，紅色為LoxP位點(diǎn)；

圖3為引物設(shè)計策略；

圖4為F1代小鼠鑒定電泳圖。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明提供了一種利用CRISPR-Cas9條件性敲除肝臟HO-1基因動物模型的構(gòu)建方法，包括以下步驟：