[發明專利]用于生物熒光芯片的自動對焦方法

有效

• 申請號: 202010090432.1
• 申請日: 2020-02-13
• 公開（公告）號: CN111212237B
• 公開（公告）日: 2021-10-22
• 發明（設計）人: 周連群;朱文艷;張芷齊;姚佳;李金澤;郭振;李龍輝;高旭;李樹力
• 申請（專利權）人: 中國科學院蘇州生物醫學工程技術研究所
• 主分類號: H04N5/232
• 分類號: H04N5/232
• 代理公司: 北京遠大卓悅知識產權代理有限公司 11369
• 代理人: 張川

本發明公開了一種用于生物熒光芯片的自動對焦方法，包括以下步驟：自適應窗口選取；自適應閾值選取；計算離焦距離和離焦方向；實現樣本對焦。本發明根據微孔式PCR芯片的微孔及排列特征自適應的選擇及調整窗口位置，以保證對焦對象及其邊界區域位于對焦窗口內；根據對焦對象亮度的高低自適應的調整閾值，變化的閾值給后續不同亮度的樣本在其對焦曲線的一致性上奠定了基礎；本發明得出了微孔式數字PCR芯片熒光圖像隨離焦距離的變化、其大于閾值的像素數的變化曲線及其分段函數后，根據分段函數及方向判別方法，只需3個位置的熒光圖像，即可得出離焦距離和離焦方向，再需一步即可完成對焦，整個過程僅需4步完成對焦。

技術領域

本發明涉及生物成像領域，特別涉及一種用于生物熒光芯片的自動對焦方法。

背景技術

數字聚合酶鏈反應(Digital polymerase chain reaction，dPCR)是一種測量靶DNA絕對拷貝數的獨特方法，是一種絕對定量技術，最早由Saiki等發表在文章里，與實時熒光定量PCR(Real-time Quantitative PCR Detecting Syste,即qPCR)相比，dPCR已被證明具有更高的靈敏度，精度及重復性。從擴增后的dPCR芯片中獲取到有用的信息依賴于dPCR檢測分析系統，如進行無創產前檢測，人類乳腺癌中HER2癌基因的檢測等。目前，dPCR熒光信息的檢測方式主要包括兩種：一是熒光成像，二是流式細胞熒光分選。熒光成像技術隨著相機成像技術的發展，其成像速度越來越快，分辨率也越來越高，這種成像方式在顯微成像中得到越來越廣泛的應用。

而相機成像存在失焦的問題，特別是像dPCR這樣，需要通過處理得到的圖像數據來獲得生物信息數據，若圖像離焦問題嚴重，則會影響統計數據的準確性。不同樣本之間垂直位置的差異性，導致相機獲得的圖像呈現不同程度的模糊，因此，對焦在光學視覺成像系統中起著重要作用，例如各類相機，掃描儀，顯微鏡。而自動對焦優勢體現在：可以在最少的人工干預下獲得清晰圖像，進而獲得準確的統計數據。為了快速獲取清晰的圖像以便于后續數據處理得到準確的檢測結果，必須根據樣品變化動態的改變樣品與物鏡或物鏡與成像面之間的距離，以實現樣品的自動對焦。

自動對焦可以通過主動、被動或者兩者混合來實現。主動方法一般是通過激光等測距工具來測量離焦距離后進行對焦。主動方法需要在系統中額外嵌入測距系統，并且當使用激光時，會造成基因芯片上的熒光基團淬滅，對后續數據的準確性造成影響。被動方法可以分為相位檢測法和對比度檢測法，前者通過測量兩幅圖像之間的相位差來估計聚焦位置，依賴于特殊的傳感器檢測系統；后者計算每一幀的清晰度以尋找最佳位置，無需額外檢測附件，精簡整體系統，降低成本，但搜索每一幀并計算，明顯增加了計算量和搜索步驟，造成對焦時間延長。

微孔式數字PCR芯片面積大，通量高，弱熒光樣本分布差異造成其計算對象存在片內差異與片間差異，若對焦方法不當，熒光基團長時間暴露在激發光下會發生淬滅，會影響后續結果統計。

發明內容

本發明所要解決的技術問題在于針對上述現有技術中的不足，提供一種用于生物熒光芯片的自動對焦方法。

考慮到微孔式數字PCR芯片面積大，通量高，弱熒光樣本分布差異造成其計算對象存在片內差異與片間差異，若對焦方法不當，熒光基團長時間暴露在激發光下會發生淬滅，影響后續結果統計,為了實現快速準確對焦，本發明基于dPCR芯片多個排列孔的特征，提出了一種新的對焦算法，單曲線擬合函數法，通過計算包含單個孔的區域內大于閾值的像素的個數，得到隨離焦距離變化，該區域內大于閾值的像素數變化曲線。在這里，閾值隨圖像平均灰度的變化而變化，從而得到一條與圖像灰度無關的像素數隨離焦距離變化曲線，通過正弦函數擬合得到該曲線的擬合函數，即為微孔式dPCR芯片的對焦評價算法。通過該對焦算法，可以快速的得到離焦圖像的離焦距離與離焦方向，進而快速而準確的完成對焦。

本發明采用的技術方案是：一種用于生物熒光芯片的自動對焦方法，包括以下步驟：

1)取相，選擇一個窗口區域的圖像；