[發明專利]BRCA1/2突變檢測組合物、試劑盒及文庫構建方法

有效

• 申請號: 202010086603.3
• 申請日: 2020-02-11
• 公開（公告）號: CN111269980B
• 公開（公告）日: 2023-06-16
• 發明（設計）人: 陳明;左中和;郭鑫武;曾敏;李金良;劉讓蛟;戴立忠
• 申請（專利權）人: 圣湘生物科技股份有限公司
• 主分類號: C12Q1/6886
• 分類號: C12Q1/6886;C12N15/11;C40B50/06;C40B40/08
• 代理公司: 北京派特恩知識產權代理有限公司 11270
• 代理人: 任曉;張穎玲

本發明提供了一種BRCA1/2基因突變的組合物，所述組合物包括如SEQ?ID?NO:1?92所示的寡核苷酸。使用本發明的組合物可以通過46對引物的2個PCR反應體系擴增BRCA1/2基因以檢測突變。成本低，方法簡單，樣品起始量僅需10ng，同時本發明的組合物涵蓋BRCA1/2基因的全部外顯子和內含子邊界的±20bp，其檢測突變更為完全、準確，靈敏度高。本發明還提供了BRCA1/2基因突變的檢測試劑盒及BRCA基因文庫的構建方法。

技術領域

本發明涉及基因突變檢測領域，具體地，涉及一種BRCA1/2基因突變檢測組合物、試劑盒及文庫構建方法。

背景技術

乳腺癌、卵巢癌是威脅女性健康的最常見的惡性腫瘤。BRCA1/2是目前研究較為普遍與乳腺癌和卵巢癌發生有密切關聯的兩個易感基因，在DNA損傷修復、細胞周期調節、基因轉錄激活、染色質穩定等方面發揮著重要作用。研究表明，約2％-6％的女性乳腺癌患者和10％-15％的卵巢癌患者存在BRCA1/2?基因突變。BRCA1/2這兩個基因的突變狀態與家族性乳腺癌、卵巢癌的發病關系十分密切。與無突變者/普通人群相比，攜帶BRCA1/2基因突變的個體發展成為乳腺癌和卵巢癌的患病風險和復發風險均顯著增加。攜帶有BRCA1/2基因突變的女性在其一生中最高有87％的可能性發生乳腺癌。BRCA1/2有害突變還可能增加患胰腺癌，胃癌，膽囊和膽管細胞癌，黑色素瘤和前列腺癌等其它風險。因此，對乳腺癌/卵巢癌高風險人群進行BRCA1/2基因檢測很有必要。據乳腺癌信息中心(Breast?CancerInformation?Core,BIC)報道：BRCA1、BRCA2?的基因突變已達3000多種，這些突變分布于整個編碼區。最常見的致病突變為移碼突變、無義突變等，沒有明顯的突變熱點。大多數突變導致截短蛋白的生成，使得BRCA1、BRCA2蛋白質正常功能的喪失，從而導致腫瘤發生。

攜帶有BRCA1/2基因致病突變的患者可使用PARP抑制劑殺死腫瘤細胞。阿斯利康的PARP抑制劑奧拉帕尼在美國、歐盟、中國澳門已上市。作為全球第一個口服的卵巢癌靶向抑制劑，鉑敏感復發的BRCA1/2突變亞組卵巢癌人群維持治療的PFS較復用安慰劑組可提高6.9個月。此外，目前還有不少于5種的類似PARP抑制劑也在積極研發當中。檢測BRCA可指導含鉑化療方案的療效：攜帶BRCA致病突變的上皮卵巢癌患者對鉑類為基礎的化療反應顯著優于非突變者。攜帶BRCA致病突變的患者可考慮進一步鑒別其一級親屬罹患卵巢癌(或乳腺癌)的風險，提前制定隨訪和預防策略。

傳統的Sanger測序是目前國內臨床檢測BRCA1/2基因突變的主要檢測手段。從檢測靈敏度上講，Sanger測序一般只能檢測20％以上突變率的變異，對?BRCA1/2全部編碼序列及鄰近內含子序列檢測來說，檢測通量較低、周期長，單樣品檢測費用也較高。另外，市面上也有基于高分辨率熔點曲線分析(High?Resolution?Melting?Analysis，HRM)技術的檢測試劑盒，但僅能檢測幾個已知位點，其作用非常有限。隨著高通量測序技術的普及，該技術被應用于越來越多的基因檢測項目。常見的靶向高通量測序方法主要包括多重擴增子測序和雜交捕獲測序。多重擴增子文庫制備方法簡單，時間短，成本低，但其擴增子長度限制了測序儀和測序試劑盒的選擇，并且其還需要考慮引物的多重性(即PCR?的反應體系)以及引物的對數。

中國發明專利CN107267600A公開了一種多重擴增BRCA基因的方法，其需要26對引物即可以擴增全部外顯子區域和部分內含子區域，但是其26對引物需要5個PCR反應體系，方法非常復雜且耗費時間，并且其樣品起始量要求高，至少需要60ng?DNA。發明專利WO2018036176A1雖然只需要兩個PCR反應體系就能完成多重擴增BRCA基因，但是其一共需要117對引物，并且僅能覆蓋內含子邊界的10個堿基，方法非常復雜且引物成本很高，以及其樣品起始量要求較高，需要20ng?DNA。中國發明專利CN?110129414A采用多重擴增后連接接頭測序，所述方法簡單，但其采用單管中短片段多重擴增，其公布的特異性引物顯示靶區域限定在BRCA1/2基因的部分外顯子片段，不能覆蓋?BRCA1/2基因分布的所有外顯子編碼區。