[發明專利]用于間充質干細胞膜蛋白定性分析的組合物及方法和應用

在審

• 申請號: 202010086517.2
• 申請日: 2020-02-10
• 公開（公告）號: CN111235155A
• 公開（公告）日: 2020-06-05
• 發明（設計）人: 章毅;朱小立;伍婷;任靈杰;陳侃俊;劉曉浩;陳亮
• 申請（專利權）人: 章毅;中國干細胞集團上海生物科技有限公司;重慶市干細胞技術有限公司;中國干細胞集團海南博鰲附屬干細胞醫院有限公司;上海市干細胞技術有限公司;陜西省干細胞技術有限公司;蘇州市干細胞技術有限公司;三亞市干細胞技術有限公司
• 主分類號: C12N15/115
• 分類號: C12N15/115;C12Q1/6844;G01N21/64
• 代理公司: 上海市海華永泰律師事務所 31302
• 代理人: 包文超

一種用于間充質干細胞膜蛋白定性分析的組合物，包括SEQ ID No 1所示的寡聚脫氧核糖核苷酸鏈，其5′末端標記了熒光基團。本發明通過DNA鏈識別細胞的膜蛋白以及獲得擴增的熒光信號，從而實現對靶標細胞膜蛋白的無損分析，還可以根據靶標細胞(如：間充質干細胞甚至其他不同種類細胞表面的膜蛋白)的特定檢測需求而量身定制，滿足不同分析的實際需求，具有良好的應用潛能。

技術領域

本發明涉及一種用于檢測的組合物，特別涉及一種對蛋白質進行定性檢測的組合物，實現對間充質干細胞膜蛋白無損分析。

背景技術

間充質細胞(Mesenchymal stem cells，MSCs)起源于胚胎中胚層的干細胞，廣泛存在于機體各處。其中，間充質干細胞屬于中胚層的一類多能干細胞，主要存在于結締組織和器官間質中，集中在骨髓和脂肪組織中，并具有多種潛能。在特定條件下，可以在體內和體外被誘導分化為不同類型的細胞，如：軟骨細胞、成骨細胞、脂肪細胞、神經細胞和心肌細胞等。其易于分離和培養，體外擴增潛能高。臨床實驗證實，間充質干細胞移植可用于組織修復及治療間充質組織遺傳缺陷性疾病，是一種極具吸引力的治療工具。CD44蛋白是一組分布廣泛，分子量為(85～160)×10kD的多分子形式的膜整合蛋白，介導細胞與細胞間及細胞與細胞外基質間的相互作用，CD44在很多種腫瘤細胞的表達比相應正常組織為高，并與腫瘤細胞的成瘤性、侵襲性及淋巴轉移性有關。因此，對間充質干細胞膜蛋白標志物CD44的分析可以為多種骨疾病、肺損傷、糖尿病、神經系統疾病、自身免疫性疾病等疾病的臨床判斷提供許多重要的信息。

關于檢測CD44蛋白的方法有很多種，但都是傳統的免疫熒光(IF)，免疫印跡(WB)和質譜(MS)等方法。免疫印跡和質譜的方法雖然可以提供蛋白質的定量信息，但對細胞具有破壞性，需要裂解細胞并先提取蛋白質。免疫熒光技術是一種強大的免疫化學技術，可通過熒光團修飾抗體原位非結構破壞性地檢測多種膜蛋白。但該方法需要用抗體對靶蛋自進行不可逆標記，這可能會不可預測地影響膜蛋白和細胞的活性。DNA是脫氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid)的簡稱，作為一種天然的生物大分子，在納米尺度上構建功能結構方面有得天獨厚的優勢。DNA納米技術自提出以來，因具有結構可編程性、良好的生物相容性和生物穩定性、無明顯的細胞毒性和免疫刺激性，以及能夠自主入胞等特點，在生物醫藥領域引起了廣泛的關注，已經用于腫瘤的成像與檢測。

發明內容

本發明的一個目的在于提供一種組合物，含有熒光修飾的DNA鏈，用于對靶標細胞膜蛋白實施原位成像的定性分析。

本發明的另一個目的在于提供一種組合物，含有熒光修飾的DNA鏈，其與間充質干細胞的膜蛋白結合后，使得膜蛋白表達和細胞活性不受影響，實現無損分析。

本發明的再一個目的在于提供一種分析的細胞方法，實現對樣本中靶標細胞膜蛋白CD44的原位成像的定性分析。

本發明的又一個目的在于提供一種試劑盒，實現對樣本中靶標細胞膜蛋白CD44的原位成像的定性分析。

本發明所稱的靶標細胞，系對樣本中含有的擬檢測的細胞總稱，比如：但不限于體細胞、干細胞和癌細胞等。

一種組合物，包括：

SEQIDNo 1所示的寡聚脫氧核糖核苷酸鏈，其5′末端標記了熒光基團(如：紅色熒光基團Cy5)。

另一種組合物，包括

SEQIDNo 1所示的適體引物(Apt-Pri)，其5′末端標記了紅色熒光基團(如：Cy5)；

SEQIDNo 2所示的輔助引物(Ass-Pri)；

SEQIDNo 3所示的環狀DNA模板(LOOP)；

SEQIDNo4所示的分子信標(MB)，5′和3′端分別修飾了綠色熒光基團FAM和猝滅基團BHQ。