[發明專利]一種新型重組酶依賴型擴增方法及試劑盒

有效

• 申請號: 202010081170.2
• 申請日: 2020-02-06
• 公開（公告）號: CN111154739B
• 公開（公告）日: 2021-03-02
• 發明（設計）人: 陳翀;劉華勇;季宇;謝嬋芳;文荻琛
• 申請（專利權）人: 廣州普世利華科技有限公司;廣州普世君安生物科技有限公司
• 主分類號: C12N9/22
• 分類號: C12N9/22;C12Q1/6844;C12N15/70
• 代理公司: 廣州粵高專利商標代理有限公司 44102
• 代理人: 孫鳳俠

本發明公開了一種新型重組酶依賴型擴增方法（Recombinase?dependent amplification，RDA）及試劑盒。本發明研究得到一種新的重組酶KX及其輔助蛋白KY，可用于對核酸模板進行特異靈敏地恒溫擴增。在此基礎上本發明開發了一種新的穩定性高、特異性強、靈敏度高的重組酶依賴型擴增技術的檢測方法和檢測系統。本發明重組酶KX和KY蛋白制備工藝簡單，產量和穩定性大幅提高，量產成本低，所開發的RDA技術所需引物短，對靶標序列長度要求低，適用范圍廣，且對核酸靶標序列檢測特異性好、靈敏度高，可在25?37℃的恒溫條件下實現高靈敏、高特異性的核酸檢測，檢測成本低廉、操作方便，具有廣闊的應用前景。

技術領域

本發明屬于分子生物學技術領域。更具體地，涉及一種新型重組酶依賴型擴增技術(RDA)及基于此技術開發的檢測試劑盒。

背景技術

核酸擴增在許多分子生物學檢測方法中都是非常關鍵的一步。PCR是在1986 年就發展起來的應用最為廣泛的DNA擴增技術，常用于檢測、鑒定傳染性疾病、基因突變以及其他方面。然而，這種經典的技術需要一個溫度循環儀器使雙鏈DNA解鏈，再在等溫條件下擴增目的片段。恒溫擴增技術不需要變溫即可實現對靶標片段進行特異性擴增，對儀器的要求大為簡化，反應時間明顯縮短，降低了核酸擴增技術的應用門檻。操作方法的簡便性，使恒溫擴增技術得到了快速發展，多種新的技術方法不斷提出。在技術開發和臨床應用有較多研究的主要有重組酶聚合酶擴增技術（Recombinase Polymerase Amplification,RPA）、環介導等溫擴增技術(loop-mediated isothermal amplification, LAMP ) 等。 除此之外，還有轉錄介導擴增（TMA）、滾環擴增技術（RCA）、解旋酶依賴性擴增（HDA）等，但這些技術由于應用范圍，技術復雜等因素，都還沒有在臨床應用方面有大的突破。

其中，重組酶聚合酶擴增技術(Recombinase Polymerase Amplification，RPA)，通過模擬DNA體內擴增，在常溫條件下擴增目的片段。該技術主要依賴重組酶UvsX、重組酶UvsY、單鏈結合蛋白gp32 和鏈置換DNA聚合酶。重組酶UvsX能夠不通過加熱就解開雙鏈DNA，重組酶聚合酶擴增反應開始時，重組酶UvsX利用ATP結合引物，形成重組酶UvsX-引物復合體，這些復合體能夠識別與之互補的目標雙鏈DNA；接著重組酶引物復合體侵入目標雙鏈DNA 5’端位點形成D狀環，單鏈結合蛋白gp32與被置換單鏈結合使其不能復性。同時，鏈置換DNA聚合酶結合在引物3’端進行鏈延伸，形成新的互補鏈。重組酶聚合酶擴增技術中，重組酶UvsY可以改變重組酶UvsX-引物復合體解離及重新結合的可逆反應過程，使反應向更有利于RPA 的進行，此外肌酸激酶可以使擴增過程中形成的ADP再生為ATP，保持擴增反應持續穩定的進行。

作為一項相對新的技術，重組酶聚合酶擴增技術（RPA）尚未得到廣泛的應用，但其具有靈敏度高、特異性強、操作快速便捷、反應快速等優點，且該技術對硬件設備的要求很低，無需精密儀器，適合用于體外診斷、獸醫、食品安全、生物安全、農業等領域。上述技術優勢使重組酶聚合酶擴增技術同其他等溫擴增技術相比更適于床旁診斷或疾病防控等現場快速檢測，被稱為是可以替代PCR的核酸檢測技術。

雖然重組酶聚合酶擴增技術（RPA）具有以上優點及應用前景，但該技術本身還存在著一些缺點和不足，RPA反應體系中包含UvsX、UvsY、gp32、肌酸激酶、Bsu DNA 聚合酶五種蛋白酶，對工具酶的活性及質量有較高的要求，反應體系中蛋白的工業化生產工藝復雜，量產成本高。如重組酶UvsX在含有50%的甘油的保存液中依然會在低溫（-20℃）凝結，使其長期穩定保存較為困難；UvsY對反應體系中的鹽離子濃度敏感，活性不穩定。其次，RPA反應所需的探針和引物比其他核酸擴增技術長（需30-35bp），不適用于短序列核酸檢測，對靶標序列的要求高，導致引物設計和產品開發難度大。

發明內容